黄冠，曹慧，符海鑫，张娜

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

0 引言

14-3-3蛋白作为一类适配蛋白，因其参与许多重要的细胞过程而在细胞生物学中占据重要地位[1]。越来越多的证据表明，14-3-3蛋白家族大多处于信号转导的枢纽，在细胞运转过程中扮演调节细胞内信息交换的重要角色[2]。14-3-3蛋白家族在哺乳动物中共有7种亚型[3]，在进化过程中极为保守[4]，主要分布在神经组织中[5]，约占脑内总蛋白含量3%，占可溶性总蛋白含量1%[6]。14-3-3蛋白参与许多细胞内重要的生命活动和发生过程，涉及细胞周期检验点调控、离子通道功能和定位、细胞转导、细胞凋亡、肿瘤发育等诸多生理病理过程[7]。eIF2α激酶是一个由7种特征明确的丝氨酸-苏氨酸激酶组成的家族，即

PERK（PKR-like ER kinase）、PKR（protein kinase double-stranded RNA-dependent）、GCN 2（general control non-derepressible-2）和HRI（heme-regulated inhibitor）。它们在应对感染、蛋白毒性和低水平必需营养物（如氨基酸和血红素）时发挥重要且通常是必需的功能[8]。eIF2α的磷酸化通过降低蛋白质合成的总体速率来保护细胞，并使细胞的翻译起始机制偏向于在应激反应中起作用基因的mRNA的翻译[9-10]。由于这些原因，eIF2α磷酸化及随后的信号传导途径被称为“综合应激反应（ISR，integrated stress response）”[10]。在泌乳生物学中，泌乳期奶牛乳腺会不间断地大量合成蛋白质以供给细胞正常运行和乳汁的形成，由此产生大量的错误折叠蛋白反应在乳腺上皮细胞内质网中积累而激活PERK引发内质网应激，通过eIF2α的磷酸化，PERK阻止了新多肽的合成，从而减少了新生多肽进入内质网腔的过程[11]。14-3-3β参与奶牛乳腺上皮细胞内质网应激和调控泌乳的详细分子机制尚不清楚。本实验旨在验证14-3-3β抑制对乳腺上皮细胞内质网应激关键因子eIF2α和ATF4以及对泌乳效应的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

DM EM/F12培养基粉末、I型胶原酶，美国Gibco公司；Lipofectamine®2000 Reagent，美国Invitrogen公司；胎牛血清，以色列BI公司；脱脂乳粉，美国BD公司；14-3-3β抗体，美国BOSTER公司；p-eIF2α一抗、BCA蛋白浓度试剂盒、MTT细胞增殖检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；β-酪蛋白抗体，美国SANTA公司；β-actin抗体，北京博奥森生物技术有限公司；ATF4抗体，美国BOSTER公司；HRP辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗、ECL发光检测试剂，北京兰杰柯科技有限公司。

1.2 仪器与设备

CO2细胞培养箱，中国香港力康发展有限公司；生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司；QuantStudio实时荧光定量PCR系统，美国Invitrogen公司；Tanon5200全自动化学发光图像分析系统，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和纯化

采用胶原酶消化法从泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺中分离并培养原代的乳腺上皮细胞。用15%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）以及Dulbecco’s modified Eagle’s medium-F12®培养基在37℃，5%CO2的条件下培养奶牛乳腺上皮细胞并进行纯化。纯化后的奶牛乳腺上皮细胞，观察上皮细胞形态和免疫荧光检测奶牛乳腺上皮细胞生物标志物CK18的表达。

1.3.2 Western Blot

提取3个时期乳腺组织的蛋白样品，BCA蛋白浓度试剂盒测定所提取蛋白样品的浓度。采用Western Blot检测各个时期的目标蛋白表达水平，总蛋白裂解液在10%的SDS-PAGE电泳中分离，然后转移到硝酸纤维素（NC）膜上。用5%脱脂乳封闭载有蛋白的NC膜，37℃封闭2 h。4℃环境下使用一抗过夜孵育NC膜。抗体如下：14-3-3β，p-eIF2α（Ser51），β-casein，β-actin，ATF4。彻底漂洗NC膜，并使用HRP标记的二抗在37°C条件下孵育1 h。ECL发光检测试剂检测目的蛋白条带，并采用ImageJ®进行灰度分析。

1.3.3 RNA干扰实验

转染siRNA于奶牛乳腺细胞中来敲除14-3-3β基因表达。正常培养的乳腺上皮细胞达到70%～80%融合率，20μmol/L siRNA或阴性对照oligo（NC）用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000转染细胞24 h后收集各组细胞样品，用qRT-PCR确定最高干扰效率的siRNA。3个针对14-3-3βmRNA不同区域的siRNA，其中干扰效率最高的14-3-3βsiRNA序列如下：

1.3.4 实时荧光定量PCR

Trizol法提取细胞总RNA，反转录进行cDNA的合成。反应体系为20μL，并用两步法进行实时荧光定量PCR。

1.3.5 甘油三酯检测

甘油三酯试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.6 MTT法检测细胞增殖

向96孔板每孔中接种大约1 000个细胞，细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，进行转染以及加药处理。后按照MTT细胞增殖检测试剂盒说明书进行操作。

1.3.7 数据处理与统计分析

本实验收集的所有数据均来自3个独立实验，以平均数±标准误差表示。采用R Language（version 4.0.2）进行统计学的显著性检验。One Way ANOVA对组间均值进行统计学比较，Tukey’s post-hoc-test分析各组平均值之间的差异。“*”表示P＜0.05，差异显著；“**”表示P＜0.01，差异极显著。P＜0.05或P＜0.01均被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同发育时期的奶牛乳腺14-3-3β，eIF2α和ATF4的mRNA表达水平差异检测

采用qRT-PCR检测青春期、泌乳期和退化期奶牛乳腺14-3-3β，eIF2α和ATF4的mRNA表达水平。结果如图1所示，14-3-3β在青春期和退化期的mRNA表达水平基本一致，在泌乳期的表达水平最低；eIF2α在青春期和退化期的mRNA表达水平无明显差异，在泌乳期的表达水平最低；ATF4在青春期的mRNA表达水平最高，而在泌乳期和退化期的表达水平无显著差异。

图1 不同发育时期14-3-3β，eIF2α和ATF4的mRNA表达水平

2.2 不同发育时期的奶牛乳腺14-3-3β，p-eIF2α和ATF4的蛋白表达水平差异检测

采用Western Blot检测青春期、泌乳期和退化期奶牛乳腺14-3-3β，p-eIF2α和ATF4的蛋白表达水平。结果如图2所示，14-3-3β在退化期的蛋白表达水平最高，在泌乳期的表达水平最低；p-eIF2α在青春期和退化期的蛋白表达水平基本一致，在泌乳期的表达水平最高。ATF4在青春期的蛋白表达水平最高，在退化期的表达水平最低。

图2 不同发育时期14-3-3β，p-eIF2α和ATF4的蛋白表达水平

2.3 内质网应激时14-3-3β抑制对ER应激相关基因的mRNA表达水平的影响

14-3-3β-siRNA转染到奶牛乳腺上皮细胞正常培养24 h，如图3所示，qRT-PCR分析表明14-3-3β的mRNA表达水平明显下降。添加TG（1 umol/L）于正常培养和14-3-3β敲除后的奶牛乳腺上皮细胞中继续培养24 h。结果如图4所示，在TG处理24 h之后，正常培养的细胞中eIF2α、ATF4、CHOP和Caspase-3的mRNA都有明显的提高。在14-3-3β敲除后再添加TG处理的细胞中，eIF2α和ATF4的mRNA表达水平进一步明显增加，同时CHOP和Caspase-3的mRNA表达水平显示为指数级激增。

图3 RNAi处理24 h的14-3-3β的mRNA表达水平

图4 TG处理正常培养和14-3-3β敲除24 h后细胞应激相关基因的mRNA表达水平

2.4 内质网应激时14-3-3β抑制对酪蛋白的m RNA和蛋白表达水平的影响

14-3-3β-siRNA转染到奶牛乳腺上皮细胞正常培养24 h，添加TG（1 umol/L）于正常培养和14-3-3β敲除后的奶牛乳腺上皮细胞中继续培养24 h。结果如图5～6所示，在TG处理24 h之后，正常培养的细胞中β-casein的mRNA和蛋白表达水平都有明显下调，在14-3-3β敲除后再添加TG处理的细胞中，β-casein的mRNA和蛋白表达水平进一步降低。

图5 TG处理正常培养和14-3-3β敲除24 h后细胞相关的mRNA表达水平

图6 TG处理正常培养和14-3-3β敲除24 h后β-酪蛋白的蛋白表达水平

2.5 内质网应激时14-3-3β抑制对BMECs乳脂的影响

如图7所示，甘油三酯检测结果表明，在TG处理24 h之后，正常培养的细胞中甘油三酯的含量有明显下降，在14-3-3β敲除后再添加TG处理的细胞中，甘油三酯的含量进一步降低。

图7 TG处理正常培养和14-3-3β敲除24 h后甘油三酯含量的变化

2.6 内质网应激时14-3-3β抑制对BMECs细胞增殖的影响

如图8所示，MTT法检测结果表明，在TG处理24 h之后，正常培养的细胞增殖率显著降低，在14-3-3β敲除后再添加TG处理的细胞中，细胞增殖率进一步降低。

图8 TG处理正常培养和14-3-3β敲除24 h后的细胞增殖状态

3 讨论

14-3-3蛋白通过调节各种结合分子的功能，已成为许多重要细胞过程如信号转导蛋白合成、蛋白折叠和降解、细胞周期、细胞骨架重排、细胞运输、DNA复制、凋亡和生存等关键调控的组分[12]。以往的研究中，14-3-3家族的其他成员如14-3-3γ，与奶牛泌乳调控和细胞增殖中正向调控效应相关联[13-15]，14-3-3ζ与神经元的内质网功能有关，14-3-3ζ的下调引起ER应激并增加对兴奋性毒性损伤的脆弱性[16]。在本实验中发现泌乳期的奶牛乳腺组织14-3-3β和p-eIF2α呈显著的负相关，提示泌乳期14-3-3β与应激有关的翻译起始因子2α可能有某种关联。泌乳期的奶牛需要合成大量的蛋白质，mRNA的翻译过程的动态平衡是保证细胞正常合成蛋白必需的。翻译起始是整个蛋白质合成过程的限速步骤，而eIF2α是翻译起始的重要蛋白[17]。细胞为存活而出现了一种高度保守的应激诱导途径—综合应激反应[18]，当外部环境条件对细胞适应性有害时，ISR通过停止整体翻译来维持细胞稳定。ISR能够感知独特的应激源并磷酸化eIF2α，从而减弱m RNA 5’端帽状结构依赖的翻译[19]。以ER应激为实验背景，奶牛乳腺上皮细胞在14-3-3β敲除后对TG诱导的ER应激反应更为敏感，表现为eIF2α和ATF4的mRNA激增，而CHOP和Caspase-3的mRNA迅速增加与先前的14-3-3β敲除研究结果一致[20]。在TG的作用下，14-3-3β基因敲除诱导内质网管腔的形态学改变，并进一步促进内质网Ca2+外流[21]。14-3-3β蛋白作为接头蛋白和伴侣的活性在上述条件下可能起重要作用。当敲除14-3-3β基因时，细胞中eIF2α磷酸化水平进一步升高，ER应激持续存在，导致蛋白质翻译持续关闭，eIF2α下游的ATF4激活不同的转录程序，以恢复内在平衡重建内质网稳态[22-23]，或者在慢性压力下，协同CHOP来激活Caspase家族并诱导细胞凋亡[24]。而eIF2α磷酸化状态的持续时间和水平以及平行时间里激活的其他信号通路将决定eIF2α的磷酸化最终是促进死亡还是促进生存[25-26]。乳蛋白分泌特性的高低是衡量乳品质优良的标准，实验显示出在内质网应激状态下，14-3-3β敲除进一步下调了β-酪蛋白的mRNA和蛋白双重水平的表达，并减少了乳脂的分泌，同时减缓了细胞增殖，提示14-3-3β能够正向调控泌乳效应，对于维持细胞增殖状态，乳蛋白和乳脂的表达是有必要的。

综上所述，14-3-3β能够正向调控泌乳，并参与ER应激关键因子eIF2α和ATF4的调控。找到精准改良乳品质的方法是必要的，不可否认14-3-3蛋白作为候选靶标具有广阔的前景，然而这一过程有关的分子机制还有待深入研究。