王艳丽 张爱民 常艳敏

天津市南开医院(300100)

宫颈癌发生机制复杂，核因子-κB、遗传方式的改变均与宫颈癌的发生有关，深入了解其发生机制及治疗方法以提高其治愈率[1-3]。芒柄花黄素作为黄芪、当归等天然中草药的主要活性成分，具有提高免疫力、抗炎、抗氧化等功效；体外实验发现，其在卵巢癌、胃癌、宫颈癌中通过抑制癌细胞增殖和促进细胞凋亡达到抗癌作用[4]。miRNA可通过降解或阻断靶基因翻译调节基因表达，从而参与多种癌症的发生发展。研究表明miR-587在肝癌[5]、宫颈癌[2]等中异常表达，并与患者预后不良相关；还有研究表明其在宫颈癌细胞中表达显著上调[3,5]。锌指蛋白3(ZNRF3)作为E3泛素连接酶在多种肿瘤中起抑癌基因作用[6]。目前，关于芒柄花黄素在宫颈癌中的抗癌作用是否与miR-587、ZNRF3有关还未可知。因此，本研究对芒柄花黄素调控miR-587/ZNRF3轴对宫颈癌细胞迁移、侵袭产生影响进行探究，以期为宫颈癌的靶向治疗机制研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

芒柄花黄素(D0913-20mg)购自上海宝曼生物科技有限公司；宫颈癌细胞(Hela)细胞株(ZQ0068)购自上海中乔新舟生物科技有限公司；青霉素-链霉素(LM1200K)购自上海联迈生物工程有限公司；胰酶溶液(PYG0065)购自武汉博士德生物工程有限公司；RPMI-1640培养基(PM150110)、胎牛血清(164210-500)、pmirGLO质粒(E1330)购自武汉益普生物科技有限公司；BCA蛋白检测试剂盒、兔抗人MMP9、MMP-2、ZNRF3、GAPDH、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗抗体(ALH371-QIP、K20437-QUH、K10389-DYJ、K27159-XMQ、K16389-KDP、WE0381-QAN)购自北京百奥莱博科技有限公司；蛋白提取试剂盒(CD-13559-ML)购自武汉纯度生物科技有限公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(11668027)购自赛默飞世尔科技；即用型荧光定量PCR试剂盒(XY-TE-0731)购自上海烜雅生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒(AR1200-100T)购自上海吉至生化科技有限公司；QIAGEN反转录试剂盒(QIAGEN)购自上海科敏生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(11402ES60)购自上海翊圣生物科技有限公司；无关序列miR-NC、miR-587 mimics均由赛默飞世尔科技合成。Bio-Rad伯乐荧光定量PCR仪CFX Connect 购自南京贝登医疗股份有限公司；蛋白凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养Hela细胞接种到RPMI-1640培养基中后置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。两天更换一次培养基；通过胰酶消化进行传代培养，将所得Hela细胞以1000 r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤去酶液，以实验的最终浓度重新悬浮。

1.2.2Hela细胞转染取对数生长期Hela(1ml)1×105个/ml种到6孔板中，每组设置6个复孔，贴壁后根据LipofectamineTM2000说明书进行Hela细胞转染：按最终浓度为5nmol/L分别将miR-NC、miR-20b-5p mimics转入相应组Hela细胞中，培养48h后在荧光显微镜中观察转染效果并检测其表达。

1.2.3Transwell法检测Hela细胞侵袭和迁移能力设置对照组、10μmol/L芒柄花黄素组(药物组)、10μmol/L芒柄花黄素+NC组(药物+NC组)、10μmol/L芒柄花黄素+miR-587 mimics组(药物+miR-587 mimics组)；转染后用10μmol/L芒柄花黄素处理48h，取对数生长期细胞进行侵袭实验：将Hela细胞悬液调整浓度为2.5×105个/ml，取200μl种于用Matrigel胶包被的Transwell小室上室，在下室加入DMEM培养基500μl培养24h，PBS清洗、棉签擦去上室未穿膜细胞，低聚甲醛30min固定，结晶紫溶液30min染色，随机选取6个视野内观察穿膜细胞并计数。迁移实验中除使用未被Matrigel胶所包被Transwell小室上室外，其余处理与侵袭操作相同。

1.2.4Westernblot检测蛋白表达CA试剂盒检测Hela细胞总蛋白(n=5)。用SDS-PAGE电泳分离蛋白后低温转膜，脱脂奶粉进行1h封闭，TBST清洗3次，加MMP9、MMP-2、ZNRF3、GAPDH一抗，4℃孵育过夜后加入二抗孵育2h，使用蛋白凝胶成像仪对MMP9、MMP-2、ZNRF3定量分析。

1.2.5双荧光素酶报告基因检测miR-587与ZNRF3靶向关系TargetScan(http://www. Targetscan. org/)，确定miR-587与ZNRF3结合位点后验证二者的靶向关系。首先将与miR-587靶向序列相结合的ZNRF3的3＇-UTR片段经扩增、酶切、连接后构建野生型和突变型ZNRF3载体：pmirGLO-ZNRF3-wt和pmirGLO-ZNRF3-mut。将接种于96孔板的对数生长期Hela细胞分为pmirGLO-ZNRF3-wt+miR-587 mimics组、pmirGLO-ZNRF3-wt+miR-NC组以及pmirGLO-ZNRF3-mut+miR-587 mimics组、pmirGLO- ZNRF3-mut+miR-NC组。根据LipofectamineTM2000说明书分别转染48h后使用双重荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性：加入200μl告基因细胞裂解液及50μl光素酶反应液检测荧光强度A后，加入反应终止液检测荧光强度B，A/B则为荧光素酶相对活性。

1.2.6实时荧光定量PCR检测各Hela细胞样本中miR-587和ZNRF3表达A提取试剂盒提取Hela细胞总RNA反转录为cDNA后 RT-PCR检测miR-587表达。以U6为内参对mRNA标准化，使用2-△△Ct分析表达水平。表1所示引物由Oligo 7和Primer 3.0软件所设计，并由生工生物工程(上海)股份有限公司所合成。

表1 实验所用qRT - PCR引物

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 miR-587转染效率

miR-587表达水平，NC组(0.99±0.20)与对照组(1.01±0.16)无差异(P>0.05)，mimics组(1.59±0.31)高于对照组(F=25.855，P=0.000)。荧光显微镜观察Hela细胞转染效果如图1(1776页)所示。

2.2 Hela细胞侵袭和迁移

由表2可知， Hela细胞的侵袭和迁移数，药物组低于对照组(P<0.05)，药物组与药物+NC组无差异(P>0.05)，药物+miR-587 mimics组高于药物组和药物+NC组但低于对照组(P<0.05)。见图2(1776页)。

表2 各组Hela细胞侵袭、迁移及蛋白表达情况

2.3 Hela细胞内侵袭和迁移相关蛋白表达

由表3可知， MMP9、MMP-2表达水平药物组低于对照组(P<0.05)，药物组与药物+NC组无差异(P>0.05)，药物+miR-587 mimics组高于药物组和药物+NC组但低于对照组(P<0.05)。见图3(1776页)。

2.4 荧光素酶报告基因检测miR-587与ZNRF3的靶向关系

TargetScan(http://www. Targetscan. org/)预测结果显示miR-587与ZNRF3有结合位点，ZNRF3是miR-587的潜在把基因(图4，1776页)。荧光素酶报告基因结果显示：与pmirGLO-ZNRF3-wt+ miR-NC组相比，pmirGLO-ZNRF3-wt+miR-587 mimics组荧光素酶活性显著降低；pmirGLO-ZNRF3-mut+miR-587 mimics组与pmirGLO-ZNRF3-mut+miR-NC组无明显变化(图5，1777页)。ZNRF3表达水平miR-587 NC组(1.01±0.20)与对照组(0.98±0.14)无差异(P>0.05)，miR-587 mimics组(0.54±0.10)低于对照组(F=35.810，P=0.000)。(见图6，1777页)。

2.5 miR-587和ZNRF3表达

相较于对照组，药物组miR-587表达水平降低， ZNRF3表达水平增加(P<0.05)；药物组与药物+NC组miR-587、ZNRF3表达水平无差异(P>0.05)；相较于药物组和药物+NC组，药物+miR-587 mimics组miR-587表达水平增加但低于对照组，ZNRF3表达水平降低但高于对照组(P>0.05)。见表3。

表3 各组miR-587和ZNRF3表达比较

3 讨论

宫颈癌是女性癌症死亡的主要原因[7]。随着HPV疫苗的接种和定期筛查，宫颈癌的发病率有所下降，但仍存在高死亡率和转移，主要原因在于其发生机制极其复杂[8]。宫颈癌发生机制的深入研究和寻找新的治疗靶点十分必要。

芒柄花黄素是一种异黄酮类植物雌激素，是黄芪等常用中草药的活性成分。多项研究表明在抗癌方面有重要作用，如在子宫内膜癌[9]、卵巢癌[10]中有效发挥抑癌作用[9]。有研究表明芒柄花黄素可通过提高机体抗氧化能力、抑制肿瘤新生血管生成、提高免疫力起到抗癌作用[11]；芒柄花黄素能够降低MMP-2、MMP-9蛋白表达水平，抑制卵巢癌细胞的侵袭迁移[12]；还有报道称缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)在宫颈癌组织中高表达与临床分期、病理分级和淋巴结转移有关，而芒柄花黄素能够通过降低HIF-1α和VEGF、表达水平抑制宫颈癌细胞增殖[13]。本研究发现，相较于对照组，药物组Hela细胞的侵袭和迁移数、MMP9、MMP-2表达水平均降低，表明芒柄花黄素能有效抑制Hela细胞的侵袭和迁移能力。

miRNA是一类非编码RNA，其介导的遗传调控广泛参与子宫颈癌的发生发展，如miR-221-3p已被作为肿瘤启动子[14]，而miR-214则可作为肿瘤抑制因子[15-16]。miR-587参与多种癌症的发生过程，研究表明过表达的miR-587通过抑制靶基因IRF6表达促进Hela细胞生长，已成为新的治疗靶点[2]。本研究发现，相较于对照组，药物组Hela细胞miR-587表达水平降低；相较于药物组和药物+NC组，药物+miR-587 mimics组Hela细胞miR-587表达水平增加但仍低于对照组。表明芒柄花黄素能够显著抑制miR-587的表达，而过表达的miR-587则能够逆转芒柄花黄素对Hela细胞侵袭迁移的抑制。

ZNRF3参与多种癌症发生，且是miR-146a、miR-106b-3p、miR-93等多种miRNA的靶基因，如miR-106b-3p通过靶向下调ZNRF3来诱导上皮-间质转化(EMT)，从而促进食道鳞状细胞癌(ESCC)癌细胞的增殖和侵袭[17-19]。研究表明异常活化的Wnt/β-catenin信号通路促进癌症的发生，而ZNRF3可通过负调控该信号通路抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭，并减弱EMT过程[19-21]。本研究结果发现，相较于对照组，药物组Hela细胞的ZNRF3表达水平增加；相较于药物组和药物+NC组，药物+miR-587 mimics组Hela细胞的ZNRF3表达水平降低但仍高于对照组。通过靶基因预测结果显示：与pmirGLO-ZNRF3-wt+ miR-NC组相比，pmirGLO-ZNRF3-wt +miR-587 mimics组荧光素酶活性降低；ZNRF3是miR-587的潜在目标基因，miR-587显著下调ZNRF3的表达。表明miR-587与ZNRF3存在靶向关系，miR-587通过降低ZNRF3表达促进Hela细胞的侵袭迁移。

综上所述，芒柄花黄素可能通过抑制miR-587表达，促进ZNRF3表达阻滞Hela细胞的迁移及侵袭。本研究不仅为宫颈癌的发生机制研究提供进一步参考，在寻找宫颈癌新的治疗靶点方面具有重要价值，但关于miR-587/ZNRF3轴在宫颈癌中的具体作用机制还需进一步研究。