王寒黎，汪向海，秦立龙，汪丽静

(皖南医学院第一附属医院 呼吸与危重症医学科，安徽 芜湖 241000)

0 引言

肺癌目前仍是全球发病以及死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]，免疫治疗已成为部分肺癌病人新的选择治疗手段。而同时免疫检查点也成为了热门研究对象。Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-3)是由Havcr2编码的一种含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白域3的细胞表面分子，最初被发现作为干扰素(IFNγ)特异性的细胞表面标记物，调节CD4+Th1(T helper 1-Th1)和CD8+Tc1(T cytotoxic-Tc1)[2]，后发现在调节性T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞(DC)、巨噬细胞中有所表达等[3][4]。Tim基因家族在鼠11号染色体中有8种(Tim1-Tim8)，而人类染色体5q33.2只有3种(Tim1，Tim3-4)[5]。两项研究表明[6][7]过度激活的T细胞和髓细胞导致淋巴细胞增生症及T细胞淋巴瘤，这两种疾病与Havcr2突变相关，Tim-3作为负性调节因子或者免疫检查点。免疫反应需要T细胞表面共刺激物质和呈递细胞(APC)表面的共刺激物质互相作用，Tim-3和PD-1(programmed death -1，PD-1)单抗是其重要的负性调节因子，抑制CD8+T细胞分泌TNF-γ和IL-2，最终抑制T细胞免疫反应[8][9]。研究发现Tim-3在多种肿瘤细胞如白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌等都有表达，且Tim-3与免疫疾病及肿瘤息息相关[10-12]。

1 Tim-3结构与T细胞

Tim家族是具有一定相似结构的Ⅰ型膜蛋白，包括可变的免疫球蛋白V区、不同长度的糖基化粘蛋白区和跨膜区[13]。除了Tim-4外Tim家族都含有酪氨酸信号的胞质尾区。Tim-3信号传导过程中，Tim-3胞质尾区的酪氨酸Y256和Y263与HLA-B相关转录物3(HLA-Bat3，B-associated transcript 3)[14]和SH2(Src homology 2)相互作用，与淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck，Lymphocytespecific protein tyrosine kinase)以活性催化的作用形式结合。Lck磷酸化形成TCR(T Cell receptor)复合物，随后Zeta链相关蛋白激酶(ZAP70)聚集到TCR复合物中，激活ZAP70、LAT(Linker for Activation of T cells)、PLCγ1 (Phospholipase C gamma 1)及Ca2+从而促进T细胞增殖。然而Tim-3配体如半乳糖凝聚集素-9(galectin-9)[15]和癌胚抗原相关细胞黏附分子-1(carcinoembyronic antigen-related cell adhesion molecule-1，CEACAM1)[16]通过酪氨酸激酶白介素-2诱导的T细胞激酶促发Y256和Y263磷酸化，导致Bat3释放，ZAP70、LAT、PLC的下调，抑制T细胞增殖。

CD8+T细胞是肿瘤清除的关键介质，肿瘤微环境(TMETumor microenvironment)中慢性激活抑制信号时使CD8+T细胞处于功能障碍或衰竭的状态。失活的T细胞促进产生促炎细胞因子，以及一些检查点受体的高表达。值得注意的是，Tim-3标志着CD8+T细胞功能失调的亚群。尽管Tim-3导致CD8+T细胞功能紊乱的确切机制尚不清楚，但推测Tim-3可能导致CD8+T细胞功能紊乱[17][18]。Tim-3通过拮抗转录因子TCF-1降低CD8+T细胞的干细胞数[19]，而TCF-1是维持干细胞和抑制效应细胞分化的重要因子，与PD-1不同，Tim-3的表达与TCF-1的表达呈负相关[20]。

鉴于黑色素瘤患者的TCF-1+CD8+T细胞与检查点阻断免疫治疗的反应呈正相关[21]，在临床前癌症模型中，Tim-3和TCF-1之间的潜在调节关系具有临床相关性，即CD8+T细胞中TCF-1+的缺失限制了对检查点阻断的反应，Tim-3表达为阴性[22][23]。在肿瘤淋巴结、脾脏或血液中的Treg中，Tim-3在人类和小鼠肿瘤中的CD4+调节性T细胞(Treg)表达水平更高[24][25]。重要的是，Tim-3+Treg表现出更具抑制性的表型[26]。然而Tim-3信号如何影响TME中CD8+T细胞和T细胞的功能表型尚不完全清楚，研究将需要使用谱系特异性突变小鼠进一步探究。

此外，一项研究报道[27]，在肝细胞癌患者功能失调的CD8+T细胞中，结合Tim-3的长非编码RNA(long-noncoding RNA that binds Tim-3，Lnc-Tim-3)的表达上调，Lnc-Tim-3与Tim-3的结合导致Bat3的释放，从而降低T细胞的活化。

2 Tim-3与树突状细胞

在树突状细胞(DC,dendritic cell)-Tim-3信号转导模型中，HMGB1(high-mobility group protein B1)可单独与多种受体相互作用，也可与DNA或脂多糖复合。HMGB1受体包括活化糖基化终产物受体(Receptor for Activated Glycation End products，RAGE)、TLR4、TLR2和IL-1R。HMGB1-DNA复合物与RAGE结合，导致内涵体中TLR9和TLR7被激活，引起一些下游转录因子的激活，如活化B细胞的核因子-κ轻链增强子(NF-κB，Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)、肿瘤相关DC的活化。Tim-3可阻断HMGB1从而抑制NF-κB介导的DC活化。同时Tim-3与DC的结合激活Btk(Bruton’s tyrosine kinase)和c-Src，这也抑制NF-κB的激活。Tim-3介导的DC抑制CXCL9的产生，从而减少CD8+T细胞向肿瘤微环境的聚集，达到抗肿瘤的目的[28]。

3 Tim-3配体

3.1 Galectin-9

Galectin-9是一种36kDaβ-d-半乳糖苷C型凝集素，为Tim-3的第一个配体。Galectin-9是一种分泌性蛋白，与小鼠Tim-3的IgV结构域上的某种碳水化合物结合，该结构域具有两个N-连接的糖基化位点[29]。Galectin-9在T淋巴细胞、DC细胞以及自然杀伤细胞NK细胞都有较高的表达，且共同参与合并及其表达[30]。Galectin-9与T细胞表面TIM-3结合，可能类似PD-1产生负性调节刺激[31]，诱导T细胞衰竭，逃避免疫监控而产生免疫逃逸。Tim-3缺乏只减少了galectin-9介导的Th1细胞40%死亡[29]，这表明galectin-9体内给药的一些效应可能是由galectin-9与Tim-3以外的受体结合介导的。事实上，galectin-9也被报道通过与CD44和IgE的相互作用发挥多种生物学功能[32][33]。体外研究乳腺癌细胞中Galectin-9通过促进癌细胞聚集来抑制转移潜能，从而限制肿瘤的侵袭及与血管内皮细胞的结合，也有报道证明其能诱导细胞凋亡和抑制肝癌的生长[34]。Galectin-9在肿瘤免疫中的负性调节作用在癌症患者中的预后价值并不明确。另一方面，有研究表明泌尿系统肿瘤[35]和非小细胞肺癌[36]患者中galectin-9高表达预测了更差的临床预后。我们需要更多的临床研究来证明galectin-9机制及预测价值。

3.2 PtdSer

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PtdSer)是一种凋亡细胞表面带负电荷的磷脂，大脑细胞为主，是Tim家族成员的配体[37]。尽管Tim-3结合PtdSer的亲和力比其他Tim家族成员至少低5倍，但已经证实Tim-3-PtdSer相互作用对体内清除凋亡细胞很重要，抗Tim-3抗体治疗的小鼠脾滤泡中凋亡细胞数量有所增加，而血抗dsDNA抗体水平升高[38]。

Tim-3与PtdSer的相互作用在癌症中的作用尚不清楚，特别是考虑到TME中PtdSer由于多种因素对癌细胞的暴露增加，包括氧化应激和化疗、放疗的影响[39]。Tim-3-PtdSer相互作用可能在介导Tim-3表达的CD8+dc吞噬凋亡细胞以及随后凋亡细胞相关抗原交叉呈递到CD8+T细胞中起重要作用[40]。此外，已有研究表明，B16黑色素瘤细胞在外表面产生表达PtdSer的微泡，并能促进肿瘤生长转移[41]。Tim-3在这一机制中的作用尚不清楚，需要进一步研究探讨。

3.3 HMGB1

HMGB1(高迁移率家族蛋白1-high-mobility group protein B1)是一种由215个氨基酸残基的染色质蛋白，被报道作为Tim-3的配体，由A-box、B-box和羧基末端构成[42]。HMGB1可由肿瘤细胞和其他细胞分泌，可单独作用，也可与DNA或脂多糖复合物相互作用。HMGB1受体包括RAGE、TLR4、TLR2和IL-1[43]。HMGB1-DNA复合物与RAGE结合，导致位于内体的TLR9和TLR7的内化和激活。这种相互作用可以刺激促炎症和免疫刺激途径。TIM-3结合其A-box结构域后，抑制核酸及HMGBl功能、阻碍Toll样受体和体内固有免疫应答[44]。

在小鼠癌症模型中，Chiba等人[45]表明，DC细胞上Tim-3作为HMGB1的分子陷阱，从而抑制核酸进入内质体，抑制TME中DC的激活。因此，他们发现Tim-3阻断剂可以提高顺铂化疗的反应效率，而顺铂可以增加人宫颈癌细胞[46]和结肠癌细胞[47]中HMGB1的表达。Tim-3-PtdSer和Tim-3-HMGB1相互作用在调节对不同化疗药物的反应中的相对作用仍有待确定。

3.4 CEACAM1

癌胚抗原相关细胞黏附分子-1(carcinoembyronic antigenrelated cell adhesion molecule-1，CEACAM1)在活化T细胞上高水平表达，同时在DC、单核细胞、巨噬细胞和黑色素瘤等肿瘤细胞表达。CEACAM1能在细胞内外结合Tim-3，也是Tim-3的配体之一。细胞内结合对Tim-3蛋白的成熟起重要作用。在小鼠结肠炎模型中，CEACAM1 高表达的T细胞使其Tim-3水平降低，伴随着效应细胞因子IFN-γ、IFN-α、IL-17A的增加。细胞外结合可以刺激Tim-3释放Bat3，从而允许Tim-3介导的TCR信号抑制[16]。

CEACAM1和Tim-3在TME功能失调的CD8+T细胞上高表达。因此，Tim-3-CEACAM1相互作用可能抑制这些细胞中顺式或反式的免疫反应。值得注意的是，CEACAM1已被证明可与自身结合，同时数据显示，CEACAM1自身相互作用比CEACAM1-TIM-3相互作用更强。尽管还需要进一步的研究来描述CEACAM1-CEACAM1和CEACAM-Tim-3相互作用的生理背景，但已经证明在体内抗Tim-3抗体干扰Tim-3与CEACAM1和PtdSer的结合[48]。

Tim-3可能同时与多个配体结合。Tim-3与PtdSer或CEACAM-1的结合并不排除与Galectin-9的结合，因为结合位点位于Tim-3 IgV结构域的对面。鉴于galectin-9具有两个相同的碳水化合物识别域，有人提出galectin-9可用于聚集Tim-3-PtdSer或Tim-3-CEACAM1复合物，从而促进Tim-3信号传导。CEACAM-1、PtdSer或galectin-9的表达是否占优势可能是Tim-3信号在特定组织中的关键决定因素。

4 总结

Tim-3由多种免疫细胞表达，且可以被不同的配体激活，关于Tim-3在TME中介导发挥的生物学效应及其作用机制有待更多的研究探讨证实。尽管最初的研究结果表明Tim-3可能作为一种共刺激受体发挥作用，但最近的报告表明，HAVCR2的功能缺失突变导致免疫系统过度激活导致的疾病，从而确立了Tim-3作为一种抑制受体的作用。目前，抗Tim-3抗体的治疗潜力正在不同类型的癌症中进行研究探讨，进一步阐明TIM-3的这些关键功能将有助于指导临床开发，为肿瘤免疫治疗提供更多的有效选择。