王瑞莉 王刘艳 雷 维,2 吴家怡 史红松 李晨阳 唐章林,2 李加纳,2 周清元,2,* 崔 翠,*

1 西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400715; 2 重庆市油菜工程技术研究中心, 重庆 400715

铝是自然界中较丰富的金属元素, 在地壳中的含量仅次于硅和氧而居于第3位[1]。在酸性土壤条件中(pH<5), 结合态铝解离成有毒害作用的活性铝[2], 而活性铝是制约作物生长的重要因素之一[3]。研究表明, 铝离子会破坏根分生组织的细胞活性,抑制细胞有丝分裂和根系生长, 影响营养吸收, 植物会表现出萎蔫矮小, 叶片黄化卷曲、老化或坏死等形态特征, 最终限制作物生长和产量[4]。油菜是重要的油料作物, 我国长江以南酸性土壤种植区每年因铝毒危害造成的油菜减产相当严重, 直接影响到我国油菜籽的产量和品质[5]。

生物对各种胁迫因子的应答, 本质上都是基因差异表达的结果。比较同一类细胞或不同类细胞在不同生理状态下的基因表达差异, 对研究生物生长发育调控及代谢机制具有重要意义。自然界中, 植物为适应和抵御铝毒胁迫, 部分植物进化出一系列的形态、生理和分子适应机制。铝毒胁迫下, 植物可以通过减轻氧化损伤、调节激素水平、分泌有机酸、启动酶保护系统、修饰细胞壁、增加逆境蛋白及脯氨酸等渗透调节物质等来阻止或减轻植物铝毒害[6]。近年来, 高通量测序技术发展迅速, 研究人员利用遗传学和基因组学在多种作物中筛选出上百个耐铝毒胁迫基因, 部分基因已被证实在作物抗性改良中具有潜在应用价值[7-10]。在拟南芥中超量表达ABC家族的蛋白复合体STAR1基因是耐铝性相关的最重要的转录因子之一[7]。基因TaALMT1在小麦根细胞中表达, 可以打通有机酸阴离子的通道, 有利于根尖分泌出苹果酸, 增强植物耐铝性[8]。Chen等[9]研究发现, 转基因烟草叶片中过表达的苹果酸脱氢酶可通过增强苹果酸的合成从而增强作物的耐铝性。还有如谷胱甘肽S转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)细胞色素P450抗氧化基因的表达在防御铝毒害的机制中起重要作用[10]。目前转录组测序技术获得转录信息比较广泛, 但差异基因数据较大, 很难筛选出关键的基因。而数量性状位点(quantitative trait locus, QTL)是通过提供基因组区域来确定基因的筛选[11-12], 可以减少筛选基因的时间和成本。因此, 部分研究将QTL定位和转录组分析相结合对植物的农艺性状和抗逆性进行分析, 从而找出与农艺性状或胁迫相关的候选基因及关键的代谢通路[13-15]。李明等[13]对甜玉米自交系耐铝亲本T56和铝敏亲本T49构建的F2:3家系苗期经铝处理后根尖组织的5个性状进行了QTL定位, 并对亲本T49和T56进行转录组分析发现, 亲本之间存在3532个差异表达基因, 其中1901个上调基因, 1631个下调基因。Wang等[14]通过整合的QTL作图和RNA测序分析, 筛选了编码热击蛋白和磷酸果糖激酶等7个基因作为参与种子衰老的候选基因。Jian等[15]通过QTL定位和RNA-Seq技术鉴定了33个与甘蓝型油菜叶片形态性状相关的候选基因。这些研究为人们了解植物的抗逆机制、生长发育机制及分子辅助育种提供了可靠依据。尽管利用QTL定位和转录组技术等方法解析了多种作物的农艺性状或逆境胁迫的应答机制,但尚未发现有关于基于QTL和转录组分析方法对甘蓝型油菜耐铝毒机制的研究。

本研究从甘蓝型油菜重组自交系(recombinant inbred lines, RILs)群体中筛选出的耐铝品系18D300和敏铝品系27011作为材料, 通过转录组测序和QTL定位相结合, 筛选油菜萌发期耐铝毒相关基因,并结合分子水平和生理来探讨油菜对铝毒胁迫的响应机制, 旨在为筛选和培育耐铝毒油菜种质资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和生长条件

由母本10D130 (敏铝品系)和父本中双11号(耐铝品系, 简称ZS11)进行杂交, 采用单粒传法连续自交7代获得含有182份株系的重组自交系(RILs)群体。其中, ZS11是中国农业科学院油料作物研究所选育的常规优质油菜品种, 10D130是由西南大学油菜工程技术研究中心通过羽衣甘蓝和芥菜型油菜进行种间杂种, 后代选育中获得的衍生品系。2017—2018年在重庆市北碚区歇马镇油菜试验基地种植该重组自交系群体, 在油菜初花期进行套袋自交, 种子完全成熟后每株系收取5株正常植株的种子, 自然风干后保存。收获的种子进行铝毒胁迫发芽试验, 7 d后, 测量各株系相对根长值, 在RILs中选取耐铝品系18D300 (R系)和敏铝品系27011 (S系)为试验材料。所有材料均由重庆市油菜工程技术研究中心提供。

1.2 试验处理

甘蓝型油菜耐铝品系18D300 (R系)和敏铝品系27011 (S系)分别在蒸馏水和由试剂A1Cl3·6H2O配置成80 µg mL-1铝毒溶液中培养7 d, 第7天时将发芽种子的根部组织切下装入离心管中, 立刻放进液氮中, 并在-80℃下保存进行生理指标测定和转录组测序。R系和S系对照组和处理组分别命名S0、ST、R0、RT。

1.3 RNA测序和差异表达基因筛选

取S0、ST、R0、RT根部组织0.5 g左右用于构建转录组文库。由上海派森诺生物科技有限公司完成RNA-seq测序和原始数据分析。由表1可知, 4个样品中共获得197,533,456个原始读数, 其中181,472,174个干净读数, 27,220,826,100碱基。97%以上和93%以上的干净读数的质量分数分别为Q20和Q30 (碱基识别准确率在99.0%和99.9%的碱基所占百分比), 表明该测序数据质量高, 可用于后续的研究分析。按照生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)对S0 vs R0、ST vs RT、S0 vs ST和R0 vs RT四组的差异表达基因进行GO富集分析, 找出差异基因显著富集的GO term, 确定差异基因行使的主要生物学功能。利用KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)途径富集分析, 找出与整个基因组背景中, 在差异表达基因中显著富集的通路。结合油菜QTL置信区间鉴定的所有基因[16], 进一步筛选出与油菜铝毒胁迫相关的基因。筛选差异表达基因条件为:表达差异倍数|log2(fold change)|≥1, 显著性Pvalue<0.05。

表1 测序质量分析Table 1 Quality analysis of sequencing data

1.4 实时定量PCR验证

根据整合转录组与QTL定位结果获得候选基因的基因序列, 选择6个候选基因, 利用Vector NTI软件设计出基因扩增引物(表2), 然后由生工生物公司合成相关引物, 以BraACTIN7基因为内参基因[17]。利用SYBR染料法在CFX96 Real-time PCR Detection System上进行实时荧光定量PCR检测。由Vazyme公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒开展RT-PCR试验。

表2 用于qRT-PCR的候选差异表达基因引物Table 2 Primers of candidate differentially expressed genes used for qRT-PCR

1.5 生理生化指标测定

分别称取R0、RT、S0、ST根部组织各0.1 g左右, 采用上海优选生物科技有限公司的试剂盒测定其过氧化氢酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)的活性, 以及脯氨酸(proline, Pro)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、苯丙氨酸(phenylalanine,PAL)及可溶性糖含量(soluble sugar, SUG)的含量。采用愈创木酚法测定POD活性; 采用紫外吸收法测定CAT活性; 采用氮蓝四唑(NBT)还原法测定SOD活性。采用茚三酮加热反应法测定Pr含量, 采用蒽酮比色法测定SUG含量, 以上指标测定均参照《植物生理学实验技术》[18]进行。采用硫代巴比妥酸(TBA)反应法[19]测定MDA含量, 采用Nairp法[20]测定PAL活性。每处理中每个指标测3次重复。

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel 2010整理数据; 运用SAS 9.0对处理后的数据进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 根系长度

由图1可知, 80 µg mL-1铝毒胁迫下, R系与S系的处理较对照相比根系长度均下降, 都受铝毒的抑制。但是RT较R0下降13.24%, 未达到显著水平,而ST较S0显著下降24.64%, 说明铝毒更能抑制S系的根长。

2.2 DEG分析

由图2可知, 分别在S0与R0中识别2770个DEGs (1606个上调, 1164个下调), R0与RT中识别1447个DEGs (485个上调, 962个下调), S0与ST中识别2358个DEGs (591个上调, 1767个下调), ST与RT中识别2769个DEGs (1724个上调, 1045个下调)。总体来看, R0 vs RT和S0 vs ST材料的下调表达的基因数量明显多于上调表达的基因数量, 说明在铝毒胁迫下, 植物主要通过基因的负调控提高对逆境的抵抗能力。

应用Venny在线软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html.)对差异表达基因进行交集和并集分析(图3)。4组比对中均表达差异的基因有58个, 只在S0 vs R0、ST vs RT、S0 vs ST与R0 vs RT中表达的差异基因分别为815、552、1219和640个。

2.3 通过GO和KEGG途径分析对DEG进行功能分类

2.3.1 R0 vs RT和S0 vs ST的DEGs分析 由图4可知, 对S0 vs ST及R0 vs RT中的DEGs进行了GO功能注释, 结果2358个DEGs和1447个DEGs分别被分配给59个和60个GO条目。其中, 涉及生物过程主要包括跨膜运输过程、胁迫反应、氧化应激反应、细胞壁组织或生物合成、细胞碳水化合物代谢过程等; 分子功能中DEGs主要被注释到催化活性、氧化还原酶活性、血红素结合、四吡咯结合、活性跨膜转运蛋白活性等; 细胞成分中, DEGs主要富集在细胞膜和细胞膜固有成分等途径。为进一步了解基因的生物学功能, 对DEGs进行KEGG途径富集分析, 结果在R0 vs RT和S0 vs ST中的显著富集项分别有13个和8个, 包含5个是共同代谢途径,以及8个和3个特殊途径(表3)。共同代谢途径涉及苯丙烷生物合成、MAPK信号通路-植物、氮素代谢、氰基氨基酸代谢、植物激素信号转导, 其中, 苯丙烷生物合成是这2组差异基因主要富集的通路(R0 vs RT中有55个DEG, S0 vs ST中有97个DEG), 说明不同铝毒耐性油菜品系既有共同路径, 也有独特途径来应对铝毒胁迫。

表3 R0 vs RT和S0 vs ST中的KEGG显著富集分析Table 3 KEGG pathway significantly overrepresented in R0 vs RT and S0 vs ST

(续表3)

2.3.2 铝毒处理下不同品系DEGs分析 为阐明R品系和S品系受到铝毒胁迫后产生共同的耐铝毒机制, 故在RT vs ST组去除R0 vs S0组后的显著差异基因进行GO和KEGG分析, 共有618个差异基因被划分到29个GO显著条目中(图5)。生物过程中主要涉及氧化应激反应、蛋白质分解过程、细胞碳水化合物代谢过程、氧化还原过程、谷氨酰胺代谢等过程; 在分子过程中, 差异基因主要被注释到氧化还原酶活性、转运蛋白活性、四吡咯结合、血红素结合、过氧化物酶活性等方面; 细胞组分中则主要涉及细胞膜、胞外区、蛋白酶体复合体、质外体、泛素连接酶复合物等方面。此外, 2组共鉴定出11条KEGG富集通路(图6), 分别是关于苯丙烷生物合成、蛋白酶体、半乳糖代谢、氮素代谢、内质网中的蛋白质加工、糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、精氨酸生物合成、托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成、维生素B6代谢、α-亚麻酸代谢途径。其中差异基因主要富集于苯丙烷生物合成代谢途径。

2.4 QTL定位与RNA测序结合后筛选的候选基因

将铝毒胁迫下油菜萌发期相关性状的QTL定位与转录组测序结果相结合, 根据拟南芥中同源基因注释,在R0 vs RT中筛出35个候选基因, 这些基因在R0中均表现为下调, 主要分布在qRGV-A01-2、qRGV- A03-3、qRGV-C03、qRBL-C08等8个QTL上(图7); 在S0 vs ST中筛出74个候选基因, 下调基因主要集中在ST中, 分布于qRGV-A01-2、qRGV-A03-3、qRGV-A08等11个QTL (图8); 而在ST vs RT中筛选出与铝毒胁迫相关的基因44个(11个下调和33个上调), 主要分布在qRGV-A01-2、qRGV-A03-1、qRGV-A03-2、qRGV-C03、qRGR-C04、qRRL-A03-2、qRRL-A09、qRRL-C03、qRBL-C08、qRDW-A09-1、qRDW-A10-211个QTL上(表4)。我们将这些主要基因归了五大类, 其中与氧化反应有关的基因有6个(13.64%), 分别是2-氧代戊二酸和铁依赖性加氧酶超家族蛋白基因BnaA03g09460D、过氧化物酶超家族蛋白基因BnaC03g08610D和B n a A0 3 g 4 7 7 2 0 D、细胞色素P 4 5 0家族基因BnaC04g10740D、氧化还原反应转录因子1 (RRTF1)基因BnaA03g52830D、醛脱氢酶2 B4 (ALDPH 4)基因BnaA03g50730D; 与植物激素相关的基因有3个(6.82%), 分别是生长素诱导的根生长(AIR1)基因BnaA09g02030D和BnaA09g02040D、乙烯响应因子104BnaA03g40380D; 与酶活性有关的基因有7个(15.91%), 主要与转移酶/水解酶类相关, 如编码的nudix水解酶同源物4 (NUDT4)的基因BnaC08g17880D、植物转化酶/果胶甲基酯酶抑制剂超家族基因BnaA01g31480D和BnaA03g47250D、α/β-水解酶超家族蛋白基因BnaA03g42860D和BnaA03g42310D以及在RT中下调的UDP-糖基转移酶超家族蛋白基因BnaC04g08480D; 与蛋白质相关的基因有26个(59.09%), 分别是一些编码转运蛋白、逆境蛋白和跨膜蛋白相关的基因, 如编码的伴侣蛋白RbcX基因BnaA03g07790D、硝酸盐转运蛋白(NRT1.8)基因BnaA03g44820D、硫酸盐转运蛋白3基因BnaA03g07660D、磷酸盐转运蛋白1基因BnaC04g06480D均是在RT中的下调基因, 而编码YGL和LRDR结构的铝诱导蛋白质基因BnaA01g28900D、胚胎后期丰富性蛋白(LEA)基因BnaA03g08870D、编码的热击蛋白的基因BnaA03g03740D和BnaA01g30490D、还有编码的锌指蛋白的基因BnaA03g09400D等均在RT中上调的逆境蛋白; 与质膜相关的基因有2个(4.54%), 分别是编码阳离子/H+交换剂17 (CHX17)基因BnaC03g62130D和冷调节413-质膜2 (COR413-PM2)基因BnaA03g40990D(图9)。

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2.5 对候选基因进行qRT-PCR验证

从表4中找出编码氧化反应相关的基因BnaA03g47720D、激素相关的基因BnaA09g02030D、逆境蛋白的基因BnaA03g03740D、跨膜运输相关的基因BnaC03g62130D以及与转运蛋白相关的基因BnaA03g53200D和BnaC03g65590D进行实时荧光定量PCR验证。RT与ST相比较, 铝毒胁迫处理后油菜根系中差异表达基因BnaA03g47720D、BnaC03g62130D、BnaA09g02030D、BnaA03g03740D上调,BnaA03g53200D和BnaC03g65590D下调,qPCR验证结果与RNA-Seq表达结果一致(图10)。

2.6 铝毒胁迫处理对萌发期油菜根部组织的生理指标

植物在逆境胁迫下遭受的伤害与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关, 其中丙二醛(malondialdehyde, MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一。由表5可知, 铝毒处理后, 油菜R系和S系根部组织MDA的含量均升高, 其中, ST相对于S0显著增加9.48%, 而RT相对于R0则增加不显,说明ST较RT品系膜氧化损伤严重。另外, 超氧化物歧化(superoxidedismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、过氧化物酶(peroxidase, POD)属于膜保护酶, 与植物的抗逆性有关。结果显示, R系和S系品种SOD活性均较对照显著上升, 其中, RT和ST的SOD活性分别增加57.6%和12.8%, 而CAT和POD活性则均较对照显著下降, 因此, SOD活性在油菜抗铝毒过程中起着重要的作用。此外, 逆境胁迫下, 植物通过增加某些代谢物含量(如Pro、SUG、PAL)抵抗逆境胁迫, Pro和SUG均可以调节及维持细胞渗透压来增加植物抗逆性; PAL属于一种诱导酶, 其活性高低控制着植物体内多种抗菌物质的合成, 因此PAL可以作为植物抗逆的一种指标。本研究发现, 油菜在铝毒处理后, R系和S系的Pro和PAL含量均升高, 且R系的Pro和PAL含量均高于S系, 但R系和S系的SUG的含量均显著性下降。说明R系可以通过积累较多的Pro和PAL含量来抵抗铝毒害。

表5 铝毒胁迫后油菜根系的生理指标Table 5 Physiological index of rapeseed root system after aluminum poison coercion

3 讨论

铝毒是酸性土壤中限制植物生长和作物产量的主要因素。研究表明, 它会诱导氧化应激和根细胞死亡[21]。本研究中, 油菜在铝毒胁迫响应下受到多个基因的调控, 对这些基因进行GO分析和功能注释分类发现, S0 vs R0、ST vs RT、S0 vs ST与R0 vs RT这4组文库DEGs中有大量基因显著富集于氧化应激反应、抗氧化活性、过氧化物酶活性和氧化还原酶活性等途径。其中过氧化物酶超家族蛋白基因BnaC03g08610D和BnaA03g47720D在R系中表现为上调, 该家族蛋白基因被证明可有效清除ROS,缓解植物生长抑制, 减轻铝诱导的氧化应激, 激活抗氧化酶系统[22-23]。结合本研究中生理指标测定结果, RT中过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性较ST相比均较高, 丙二醛(MDA)和可溶性糖(SUG)含量较低, 使其RT根中的活性氧积累较低,表明RT具有较高水平的抗氧化能力, 这也可以解释为编码氧化还原反应转录因子BnaA03g52830D等上调基因的过表达赋予RT品系氧化应激的抗性。因此,从转录组分析及生理分析来看, 铝毒可以诱导油菜根部组织产生过量的ROS, 从而引发油菜根部细胞的氧化应激反应。这些与氧化反应相关的基因在其他作物中过表达同样起到减轻植物铝毒害作用。如拟南芥过氧化物酶基因(AtPrx64)在烟草中的过表达提高了植物对铝胁迫的耐受性[24], 铝诱导下过氧化氢酶的产生和根尖抗氧化系统的变化在小麦适应铝毒害中起重要作用[25], 还有铁超氧化物歧化酶在水稻耐铝品系中高表达减轻了水稻的铝毒害[26]。通过KEGG分析发现上述4组文库中还有大量DEGs显著富集于苯丙烷类生物的合成。基因咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)、肉桂醇脱氢酶(CAD)、阿魏酸-5-羟化酶(F5H1)均在RT中上调, 与木质素合成有关。而且生理测定结果显示RT与ST根部组织的苯丙氨酸(PAL)含量均上升, 这表明该途径可能参与了油菜对铝毒胁迫的响应。还有报道称, 杉木[27]和玉米[28]经过铝毒处理后, 也有大量的差异基因均参与苯丙烷类的相关途径。

脯氨酸作为渗透调节剂具有清除ROS, 平衡细胞内氧化还原稳态和促进细胞信号传导的作用[29-30],对提高植物抗逆性有重要作用。脯氨酸由Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)催化, 然后由Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)还原而成[31]。本研究在RT中找出了编码富含脯氨酸的延伸蛋白样家族的上调基因BnaA09g29940D, 并发现油菜品种经过铝毒处理后,RT中的Pro含量增幅高于ST根中的Pro含量。由此可以看出, 耐铝毒油菜可以更好的调控基因的表达, 使其根部脯氨酸含量上升, 从而避免遭受铝毒害。还有研究表明, 小麦根中NADPH氧化酶的过表达会使脯氨酸含量的增加, 也会减轻盐胁迫诱导的氧化损伤[32], 中药材射干体内脯氨酸生物量的增加可以保护植物细胞免受铜伤害[33]。此外, 本研究还筛选出编码生长素类的基因BnaA02g22420D和BnaA09g02040D以及编码乙烯反应因子基因BnaA03g40380D均在RT中表现上调。有研究表明植物激素(ABA、生长素和乙烯)信号途径相互作用,影响小麦、紫花苜蓿等植物的发育及抵抗逆境胁迫的能力[34-36]。目前已有研究表明, 细胞壁组成的改变在抵抗铝毒害中发挥着重要作用[37]。本研究中,在RT中发现了与细胞壁松弛相关的基因, 如编码的木葡聚糖内转葡糖基化酶/水解酶的基因BnaA03g50050D以及编码的植物转化酶/果胶甲酯酶抑制剂超家族蛋白基因BnaA01g31480D和BnaA03g47250D均表现为上调。木葡聚糖内转移葡萄糖基酶/水解酶在植物细胞壁中生成, 调控着细胞的生长与分化, 对细胞壁通透性具有调节作用, 进而影响到植物的抗逆性[38]。植物转化酶/果胶甲酯酶抑制剂超家族蛋白能够抑制果胶甲酯酶活性, 而果胶甲酯酶对细胞壁强度及细胞生长均具有调节作用,所以该酶在植物的生长发育和逆境胁迫响应过程中具有重要作用[39]。因此, 细胞壁中相关基因的表达对于保护植物细胞免受逆境胁迫至关重要[40]

本研究筛选的基因BnaA03g08870D编码的植物胚胎晚期富集蛋白(LEA)以及BnaA03g03740D和BnaA03g09400D编码的锌指蛋白均是参与植物抗逆的重要逆境蛋白。编码这2类蛋白的基因在干旱、低温、高盐胁迫等逆境条件下表达水平提高[41-42]。LEA蛋白在耐铝毒胁迫的研究上相对较少, 其作用机理仍然不太完善。但是Mowla等[43]发现LEA蛋白在植物中通过清除细胞内的活性氧而具有抗氧化能力。同时, Rizhsky等[44]发现编码锌指蛋白的基因Zat12是拟南芥氧化应激反应信号转导网络的重要组成部分。还有编码热激蛋白基因BnaA01g30490D和BnaA03g03740D也参与了植物的非生物胁迫(包括铝毒害)。因此, LEA蛋白、锌指蛋白还有热激蛋白可能通过氧化应激反应途径起到油菜耐铝毒的作用。此外, 植物根部还可能会通过转录蛋白和转录因子分泌等方式来阻止 Al3+进入细胞内, 从而避免植物遭受铝毒害。如MATE转运蛋白基因和ALMT基因均与小分子有机酸的分泌紧密相关[45]。ABC通道蛋白家族中的ALS3和ALS1基因以及转运蛋白Nrat1, 均能使铝在细胞内形成复合物完成区室化,阻止Al3+进入细胞内[46]。BnaC03g65200D编码的WRKY转录因子参与MAPK植物信号通路和植物-病原体相互作用代谢途径, 在耐铝品种中其表达量上调, 有研究表明WRKY家族基因的过表达可以增强植物的耐受性和根系生长调节[47], 这意味着该转录因子对于铝的富集和解毒具有重要的耐受机制。本文还找出如基因BnaA09g30120D、BnaA03g44820D、BnaC04g06480D分别编码的硫酸盐转运蛋白91(AST91)、硝酸盐转运蛋白1.8 (NRT1.8)、磷酸盐转运蛋白等许多转运蛋白相关的基因, 说明油菜可能通过磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐等转运方式来解除铝毒伤害。这些方面的研究在荞麦中已有报道[48]。此外, 本文还找出在耐铝品种中表达量较高的MtN21转运家族蛋白, 该家族基因在小分子跨膜运输、信号转导和抗逆性等方面发挥作用[49]。故MtN21转运家族蛋白在油菜中可能具有跨膜转运Al3+功能的作用。

4 结论

通过对差异表达基因GO和KEGG功能注释分析发现, 这些基因参与了氧化应激过程、苯丙烷生物合成、植物病原体相互作用、MAPK信号传导、淀粉和蔗糖代谢、细胞碳水化合物代谢、植物激素信号转导等多种代谢途径。结合QTL定位和RNA测序数据, 共筛出与氧化应激、渗透调节、细胞壁修饰、转运蛋白、激素信号传导相关的基因44个(10个下调和34个上调)。这些基因并非单独起作用的,而是相互交叉、协同作用。从生理分析来看, 脯氨酸、苯丙氨酸解氨酶、可溶性糖、丙二醛含量和抗氧化酶活性在不同耐铝品种升降幅度不太一致, 但是相对于敏铝品种, 耐铝品种通过可以更好的调控基因表达以避免氧化损伤。最后我们将筛出具有代表性的6个基因被用于qRT-PCR检测, 其表达模式与RNA-Seq分析结果对一步研究甘蓝型油菜根部组织的抗铝毒机制具有重要的参考价值。