王邹璐琪，李立煌，李丹阳，艾超超，任 磊,*，孙本强*

（1.厦门大学材料学院，福建 厦门 361005；2.厦门医学院附属口腔医院，福建 厦门 361005）

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等菌株代谢产生的天然真菌毒素，目前已分离出十几种类型[1-2]。国际癌症研究机构将黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黄曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黄曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）和黄曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）列为人类致癌物。其中AFB1对于人类和动物而言毒性最强，具有肝毒性、致畸性和致突变性，可引起慢性肝炎、肝硬化、肝坏死等损害[3-5]。AFB1广泛存在于发霉的粮食谷物中，微量的AFB1存在就可能对人类健康产生严重危害[6-7]。因此开发一种快速检测AFB1的方法对于食品安全具有重大意义。

目前，根据GB 5009.22—2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》，检测AFB1的色谱法主要包括薄层色谱法、高效液相色谱-柱前衍生法、高效液相色谱-柱后衍生法等。虽然色谱法能定量检测AFB1，但处理样本过程较为复杂，检测时间长且不能同时检测多个样品，因此色谱法的使用范围受限[8-12]。检测AFB1的免疫分析法即酶联免疫吸附筛查法，相比于色谱法，具有样本处理简单、能同时检测多个样品、高特异性等优点[13-14]。然而，酶联免疫吸附筛查法中使用的抗体价格昂贵，限制了酶联免疫吸附筛查法在现场检测AFB1方面的应用[15]。

核酸适配体是一段DNA或RNA的寡核苷酸，能够通过分子内相互作用折叠成独特的三级构象，与靶向分子特异性结合[16]。与抗体相比，核酸适配体具有易于制备、成本低、可重复使用、不受物理或化学不稳定性及潜在免疫原性的困扰等优势，在免疫层析检测领域具有广阔的应用前景[17-18]。荧光免疫层析技术是以免疫分析技术、色谱分析技术及荧光技术为基础而发展起来的新型免疫检测技术[19-21]。该技术不仅结合了免疫分析技术与色谱分析技术的优势，还结合了荧光技术而提高了检测灵敏度并缩短了检测时间，已广泛应用于生物医学检测、食品药品监控等领域[22]。

稀土掺杂的下转换荧光纳米颗粒（down-conversion fluorescent nanoparticles，DCNPs）相比于传统的荧光材料具有发光稳定、毒性低、耐光化学降解、荧光寿命长等优势，因而在免疫层析检测领域具有应用潜力[23]。由于DCNPs具有长的荧光寿命特点，可通过时间分辨荧光技术区别低检测限的生物标记物如抗原和核酸，有效消除背景荧光的干扰[24]。因此利用DCNPs作为免疫层析检测的标记探针，能够显著提高对待测物的检测灵敏度及检测特异性。

为此，本研究将DCNPs与AFB1核酸适配体相结合，构建一种具有低成本、快速、抗干扰性强、灵敏度高等优点的新型下转换荧光-适配体免疫层析试纸条，以期实现对AFB1的快速痕量精准检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

散装花生 厦门市新华都超市厦大店；食用油中粮福临门食品有限公司；面条 河北金沙河集团。

六水合氯化铕（EuCl3·6H2O）、油酸钠（NaOA）、六水合氯化钇（YCl3·6H2O）、氟化铵（NH4F）、聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA） 美国Sigma公司；N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydro，EDC） 吉尔生化（上海）有限公司；玻璃纤维素膜（NC膜）、吸水垫、样品垫、PVC板 厦门信德科创生物科技有限公司；AFB1标准品、链霉亲和素、AFB1偶联抗原（AFB1-BSA）、AFB1适配体、适配体互补DNA生工生物工程（上海）股份有限公司；实验中所用试剂均为分析纯。

氨基修饰的AFB1适配体序列：5’-NH2-TT TTT TTT TTT TTT GTT GGG CAC GTG TTG TCTC TCT GTG TCT CGT GCC CTT CGC TAG GCC CACA-3’；生物素修饰在DNA末端，DNA探针序列：5’-AAA AAA AAA AAA AA-3’。

1.2 仪器与设备

FLS980荧光光谱仪 爱丁堡科学仪器有限公司；JEM2100型高分辨透射电子显微镜 日本JEOL公司；Is10红外光谱仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；UV-2550型紫外-分光光度计 岛津企业管理（中国）有限公司；免疫荧光分析仪 厦门信德科创生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 适配体偶联荧光纳米颗粒的制备

参考文献[25]，通过高温溶剂热法制备油相DCNPs。制备过程如下：在超纯水、无水乙醇和正己烷体积比为3∶4∶7的混合溶液中加入物质的量比为1∶3的EuCl3·6H2O与NaOA，1 000 r/min快速搅拌下升温至70 ℃，冷凝回流4 h。待反应自然冷却后，静置过夜，收集上清液通过旋蒸法获得前驱体油酸铒Eu(OA)3。用Y3Cl·6H2O替换Eu3Cl·6H2O，依据相同操作获得前驱体油酸钇Y(OA)3。在体积比为3∶7的油酸（oleic acid，OA）与1-十八烯（1-octadecene，ODE）的混合溶液中加入物质的量比为0.2∶0.3∶0.125∶2的Eu(OA)3、Y(OA)3、NaOH及NH4F，在N2氛围下升温至300 ℃，反应1 h。将生成的油相DCNPs在12 000 r/min离心20 min收集，溶于甲苯中并配制为10 mg/mL备用。

参考文献[26]方法，通过配体交换法使用聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）置换掉DCNPs表面OA配体，从而获得羧基化水相DCNPs。制备过程如下：取体积比为8∶1的二乙二醇与PAA混合溶液在N2氛围下加热至80 ℃，再加入1 mL质量浓度为10 mg/mL的溶于甲苯的NaYF4∶Eu纳米颗粒。将溶液升温至240 ℃，反应1 h。反应结束后以12 000 r/min离心20 min收集样品，并用纯水离心清洗3 遍，将样品溶解于磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）中并配制为0.1 mg/mL溶液置于4 ℃保存备用。

采用经典的EDC/NHS法将羧基化修饰的DCNPs与氨基修饰的AFB1适配体进行偶联。取5 mL质量浓度为0.1 mg/mL溶有DCNPs的PBS，避光条件下加入10 mg的EDC和10 mg的NHS进行活化，1 h后加入0.3 mg氨基修饰的AFB1适配体，反应24 h，12 000 r/min离心10 min收集产物，并置于4 ℃冰箱内备用。

1.3.2 下转换荧光-适配体免疫层析试纸条的构建

取400 μL的PBS溶液、50 μL的0.3 mg/mL生物素修饰的DNA及50 μL的2 mg/mL链霉亲和素，在室温下共孵育1 h。以12 000 r/min离心30 min，去除未反应的生物素修饰的DNA，将产物溶于500 μL的PBS，置于4 ℃冰箱内备用。

取质量浓度为0.8 mg/mL的AFB1-BSA溶液和上述制备的链霉亲和素偶联溶液，通过划线机以0.8 cm的间距分别喷涂到NC膜上形成T/C线。待T/C线构建后，将NC膜、吸水垫和样品垫按图1的顺序组装在PVC底板，并切成8 cm的长条，放置于干燥处保存备用。

图1 下转换荧光-适配体的免疫层析试纸条示意图Fig.1 Schematic diagram showing the fabrication of down-conversion fluorescence-aptamer immunochromatographic test strip

1.3.3 AFB1的检测

将AFB1标准品配制成不同质量浓度的标准溶液，将其与等体积AFB1适配体DNA修饰的DCNPs共孵育10 min。取50 μL滴加在样品垫上，待试纸条晾干后，用荧光免疫分析仪读取T/C线的荧光信号。每次独立实验进行5 次平行实验，所得数据取平均值进行分析。

1.3.4 实际样品的检测

称取实际样品（花生、食用油、面条、发霉花生）2 g，研磨粉碎并加入2 mL的70%甲醇溶液，振荡5 min后以4 000 r/min离心5 min。取上清液加入等体积超纯水。将实际样品提取物与等体积AFB1适配体DNA修饰的DCNPs共孵育10 min，并用所构建的AFB1试纸条进行检测。

2 结果与分析

2.1 DCNPs的表征

基于高温溶剂热法制备了DCNPs，通过透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）、高分辨透射电子显微镜（high resolution transmission electron microscope，HRTEM）以及选区电子衍射（selected area electron diffraction，SAED）表征（图2a～c）可以看出，DCNPs对应（100）晶面的晶格间距为0.51 nm。由计算可得，晶面衍射环分别对应（100）、（110）、（111）及（211）晶面。从X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）表征（图2d）可看出，DCNPs与NaYF4的标准晶体衍射峰（JCPDS∶28-1192）一致，因此DCNPs与NaYF4晶体有相同晶格，且无其他晶体产生。由DCNPs的制备过程可知，可能有杂质NaCl产生，结合能量色散X射线光谱（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX）分析结果（图2e）可知，并无Cl元素产生，表明所制备的DCNPs中无其他杂质生成。

图2 DCNPs的表征Fig.2 Characterization of DCNPs

通过配体交换以及EDC/NHS法制备了适配体DNA修饰的DCNPs，用于荧光免疫层析定量检测AFB1。通过TEM表征（图2a、3a、3b）可以看出，在经过PAA及DNA配体修饰后的纳米颗粒（DCNPs/PAA/DNA）的粒径略有增加，这与水合粒径表征一致（图3c）。DCNPs表面电位为20.6 mV，随着PAA和适配体DNA修饰后变为－23.5 mV和0 mV（图3c），较强的表面负电位有利于粒子在溶液中单分散，因此在TEM图中，PAA修饰后的荧光纳米颗粒（DCNPs/PAA）分散性最好。从傅里叶转换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIR）表征结果（图3d）可以看出，在经过PAA配体交换后，DCNPs/PAA显示出归属于PAA在1 732 cm－1处的C＝O特征吸收峰，表明经配体交换后，其表面带有羧基（—COOH），DCNPs成功转变为水溶性的DCNPs/PAA；AFB1的DNA适配体连接后（DCNPs/PAA/DNA），C＝O特征峰发生红移，出现了N—H伸缩振动吸收峰（3 387 cm－1）及O—H伸缩振动吸收峰（3 504 cm－1），主要与DNA的结构有关，表明其成功地被适配体DNA修饰。此外，从紫外-可见（ultravioletvisible，UV-vis）吸收光谱可以看出，经过适配体DNA修饰后，DCNPs/PAA/DNA在275 nm波长处显示出典型的适配体DNA吸收峰（图3e）。这些结果表明PAA成功将DCNPs表面的OA配体进行有效置换，并且成功将适配体DNA修饰于DCNPs/PAA上。DCNPs/PAA/DNA相比DNCPs和DCNPs/PAA在615 nm波长处的荧光强度衰减仅为8.1%和3.4%（图3f），表明经PAA配体交换后及适配体DNA修饰后的DCNPs/PAA/DNA仍保持较高的荧光特性，有利于AFB1的荧光免疫层析检测。此外，所构建的DCNPs/PAA/DNA在615 nm波长处的荧光寿命可达到5.58 ms（图3g），对比传统的半导体荧光量子点（CdS、ZnSe等）的荧光寿命仅为15～50 ns[27-29]。DCNPs较长的荧光寿命可用于时间分辨荧光检测技术领域，从而有效降低生物背景荧光的干扰，进一步提高检测灵敏度及特异性。

图3 DCNPs、DCNPs/PAA和DCNPs/PAA/DNA的材料表征Fig.3 Characterization of DCNPs, DCNPs/PAA and DCNPs/PAA/DNA

2.2 基于荧光免疫层析法检测AFB1

构建的下转换荧光-适配体免疫层析试纸条的检测原理如图4所示。取适配体DNA修饰的DCNPs与检测样本共混，若检测样本中没有AFB1，则该适配体DNA修饰的DCNPs随着层析向右移动到检测区后，表面的AFB1适配体与T线上的AFB1-BSA特异性识别从而可以被检出检测荧光峰（FT）。当适配体DNA修饰的DCNPs层析到质控区后，表面修饰的适配体DNA末端的T14与C线上的生物素修饰的DNA与链霉亲和素偶联的复合物（SA-A14）识别并结合，从而截留在上面可以被检出质控荧光峰（FC）。即两条线均显示出荧光信号时，结果为阴性。若检测样本中存在AFB1时，DCNPs适配体先与AFB1识别形成DCNPs-AFB1复合结构，随着样本中AFB1含量的增加，DCNPs与T线的结合量逐渐减少，导致检出FT值降低。而在质控区识别的机制与AFB1质量浓度无关，因此所检出的FC值较为稳定。根据FT和FC的比值，即FT/FC，可以实现对AFB1的检测同时较大程度消除背景噪声信号及不同批次实验间的干扰。检测样本的AFB1质量浓度越大，T线检出的FT值越弱，对应的FT/FC也越小。根据这一原理，可以在一定区间内获得荧光信号与AFB1质量浓度依赖的线性关系，从而应用于对AFB1含量的精确检测。

图4 下转换荧光-适配体免疫层析试纸条检测AFB1原理Fig.4 Schematic diagram showing the principle of down-conversion fluorescent-aptamer immunochromatographic test strip for detecting AFB1

2.3 检测条件的优化

2.3.1 样品溶液pH值对试纸条检测的影响

样品溶液pH值对适配体DNA修饰的DCNPs解离平衡影响较大，从而影响检测的灵敏度，因此有必要对样品溶液的pH值进行研究（图5）。结果表明，在相同条件下，当样品溶液为酸性时，FT/FC值较小；当样品溶液为中性时，FT/FC值较样品溶液为酸性时高；当样品溶液为碱性且pH 8时，FT/FC值达最大，在此条件下，最有利于检测的灵敏度。因此，选择pH 8的样品溶液进行AFB1的检测。

图5 AFB1溶液pH值对试纸条的影响Fig.5 Effect of p H of AFB1 solution on test strip performance

2.3.2 样品溶液甲醇体积分数对试纸条检测的影响

AFB1在有机溶剂中具有较大的溶解度，甲醇是AFB1的常用溶剂，探究样品溶液中甲醇含量对于AFB1实际样品检测具有重要意义。如图6所示，甲醇体积分数为15%时获得最大的FT/FC值，表明该体积分数下最有利于检测的灵敏度。因此，选择含有15%体积分数甲醇的样品溶液。

图6 AFB1溶液中甲醇体积分数对试纸条的影响Fig.6 Effect of methanol addition to AFB1 solution on test strip performance

2.4 AFB1的线性检测

配制含有不同质量浓度AFB1的标准品溶液（甲醇体积分数15%、pH 8），利用构建的下转换荧光-适配体的免疫层析试纸条进行检测，再利用式（1）进行线性拟合可得，在AFB1质量浓度为1～40 ng/mL范围内与荧光信号呈良好的线性关系，线性相关系数为0.994。检测限的计算以AFB1质量浓度为0时所检测到的（B0－B）/B0值加上3 倍的标准误差下对应的质量浓度，经计算可得检测限为0.287 ng/mL，高于GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》中对于AFB1的检测限（20 ng/mL），表明构建的下转换荧光-适配体免疫层析试纸条对于AFB1具有高灵敏检测作用。

式中：B0为空白样品中的FT/FC；B为含有AFB1标准品时的FT/FC；x为AFB1的质量浓度；a为响应因子；b为误差因子。

2.5 试纸条检测的准确性与特异性

为了验证构建的下转换荧光-适配体免疫层析试纸条在检测中的准确性，选取不同质量浓度的标准样品AFB1进行测试，结果如表1所示，由下转换荧光-适配体免疫层析试纸条检测AFB1质量浓度与标准样品AFB1质量浓度的相对误差均小于10%。

表1 下转换荧光-适配体免疫层析试纸条检测AFB1的结果Table 1Results of AFB1 detection by test strip

为验证构建下转换荧光-适配体免疫层析试纸条在检测中的特异性，分别选取AFB1、伏马毒素B1（fumonisin B1，FB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）及T-2毒素，配制成10 ng/mL的溶液，分别使用试纸条对其进行检测。由图7可知，试纸条只对AFB1检测才有明显的结果。因此，该试纸条有优良的特异性。

图7 试纸条的特异性Fig.7 Specificity of test strip

2.6 实际样品检测结果

为了验证构建的下转换荧光-适配体免疫层析试纸条在食品检测中的适用性，选取食用油、花生、面条以及发霉花生作为实际样品用于AFB1的检测。如图8所示，可以看出发霉花生样品中的（B0－B）/B0值明显高于食用油、花生、面条等样品，针对发霉花生中的AFB1检测质量浓度为（9.4±2.1）ng/mL。整个检测过程用时不超过15 min，操作简便。因此，该试纸条适用于实际样品中AFB1的高效快速定量检测。

图8 实际样品中AFB1检测结果Fig.8 Detection of AFB1 in actual samples

3 结 论

本实验利用下转换荧光-适配体构建检测AFB1的免疫层析试纸条。该检测体系对于AFB1质量浓度在1～40 ng/mL范围内具有良好的线性检测结果，相关系数为0.994，检测限为0.287 ng/mL，高于国家标准中AFB1检测限。此外，该检测试纸条具有较高的准确性及优良的特异性，能够有效针对食品中的AFB1进行检测，并且操作过程简单、耗时短，具有较高的普适性。