李 乔，马纪兵，余群力*，韩 玲

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated proteinkinase，AMPK）在动物宰后糖酵解过程中起非常重要的调节作用，其主要方式是调控糖酵解中的己糖激酶（hexokinase，HK）加速糖酵解[1]。糖酵解是宰后能量变化中一个重要过程，葡萄糖经过此反应最终被分解为乳酸[2-3]，乳酸积累使pH值下降，而pH值是影响肉品品质的重要因素。持水力对于肉品品质也十分重要，是评价肉品质量的必要性指标之一[4]，离心损失可以判断肉的持水力。目前已有研究证明AMPK能够调节糖酵解并影响牛肉的保水性能。高永芳等[5]报道，牛肉宰后成熟过程中AMPK激活剂可以提高肌肉AMPK活性，加快糖酵解使牛肉保水性变差。朱立贤等[6]研究发现，宰后早期较高温度可以提高牛背最长肌的AMPK活性并加速糖酵解，增大贮藏损失。

NO作为一种气体信号分子广泛存在于肌肉组织内，参与调节机体生理活动[7]。在生理或病理条件下提高一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）活性，可以增加NO的合成，从而诱导激活AMPK[8-10]。Xie Zhonglin等[11]发现NO可以和O2－组合形成ONOO－，其可以增加牛主动脉内皮细胞内AMPK的磷酸化。李岩等[12]报道H2S可以增加内皮细胞NO的合成，随着NO减少AMPK活性也明显降低。Calvert等[13]研究发现在敲除NOS的鼠内皮细胞内，AMPK的激活剂不能激活AMPK，说明内源性NO在激活AMPK中具有重要作用。但是，针对牛肉宰后NO对AMPK，糖酵解及肉质是否有级联调控作用却鲜见报道，动物宰后NO是否通过激活AMPK进而调控糖酵解尚不明确，因此探讨牛肉宰后NO对AMPK、糖酵解和肉品质的级联调控作用对发掘宰后牛肉品质劣变内源因素具有重要意义。

因此，本实验探讨宰后牛肉成熟72 h过程中NO对AMPK活性、糖酵解速率以及肌肉持水力的影响，并阐明NO对AMPK活性、糖酵解以及肉品质之间的级联调控机制。将对发掘影响宰后牛肉品质的内源调控因子并以此作为调控靶点进而改善肉品质具有积极促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品采集

肉样取自甘肃康美现代农牧产业集团有限公司。选取生长发育正常、健康无病、平均年龄3～4 岁的西门塔尔杂交公牛6 头，体质量（600±30）kg。参考国内外对动物福利的相关要求，严格按照GB/T 19477—2018《畜禽屠宰操作规程牛》屠宰方式进行操作，屠宰放血后（45 min内）在每头牛胴体上取下约300 g臀股四头肌，剔除表面脂肪和结缔组织并切割成2 cm×2 cm×1 cm的肉块（约5 g），随机分为4 组，每组约400 g肉样，均匀地用20 G针穿刺后与相应溶液1∶1（g/mL）混合浸泡。4 个处理组分别是：1）NO促进组，10 mmol/L二乙烯三胺（diethylenetriamine，DETA）；2）NO抑制组，20 mmol/L亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-nitro-arginine methyl ester，L-NAME）；3）对照组，0.86% NaCl；4）NO促进+AMPK抑制组，10 mmol/L DETA+40 μmol/L Compound C（AMPK抑制剂）。样品在4 ℃下浸泡12 h后取出，用滤纸吸取表面水分，然后在4 ℃成熟0、6、12、24、48、72 h。在成熟时间点取样并测定pH值和离心损失，对于其他不便立即测定的指标存放在－80 ℃超低温冰箱待用。其中，1、2、3组用于测定分析NO含量、NOS活性、AMPK活性；1、2、3、4组用于测定分析pH值、蛋白溶解性、离心损失、糖酵解酶活性等指标，每个指标测定至少重复3 次。

1.1.2 试剂

牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶联免疫检测试剂盒、NO测定试剂盒、总NOS（T-NOS）测定试剂盒、HK试剂盒、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）试剂盒、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒 南京建成生物工程研究所；NaCl、双缩脲、二亚乙基三胺、N-硝基-L-精氨酸甲酯 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004B型电子天平 上海佑科仪器有限公司；5417R型低温台式冷冻离心机 德国Eppendorf生物公司；DW-86L828型超低温冰箱 青岛海尔特种电器有限公司；HI99163型便携式pH计 意大利哈纳HANNA仪器公司；SP-756P型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；SPectramax M2型酶标仪 美国美谷分子仪器有限公司；XHF-DY型高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；离心管 安徽Biosharp公司。

1.3 方法

1.3.1 NOS活性、NO含量测定

取肉样约1 g左右，放入50 mL离心管中，按1∶9（g/mL）加入冷却匀浆介质（0.86%生理盐水），10 000 r/min冰浴匀浆30 s，匀浆2～3 次。然后4 ℃、4 000 r/min离心10～15 min，弃沉淀取上清液进行测定。测定NOS活性和NO含量时肉样前期处理一致，具体操作步骤和计算公式分别参照南京建成试剂盒说明书进行。

1.3.2 AMPK活性测定

参考Underwood等[14]的方法，取肉样0.6 g左右于10 mL离心管中，1∶5（g/mL）加入冷冻匀浆液，3 000 r/min冰浴匀浆。然后4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液进行测定。操作步骤及计算参照南京建成试剂盒说明书进行。

1.3.3 糖酵解酶活性测定

HK、PFK、PK、LDH活性的测定均采用南京建成试剂公司试剂盒，具体操作和计算参照各试剂盒的说明书。

1.3.4 pH值测定

参考Bee等[15]的方法。随机选择3 个不同部位，将便携式pH计的探针插入其中，与肌肉保持良好接触，待“Not Stable”字样消失后，读取数值，计算取平均值。

1.3.5 蛋白溶解性

肌浆蛋白质溶解性：参照Joo等[16]的方法测定。取1 g肉样加入50 mL离心管中，加入10 mL冷冻0.025 mol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.2），冰浴条件下10 000 r/min匀浆30 s，匀浆2～3 次，4 ℃振荡抽提12 h。然后进行离心处理（1 500 r/min、4 ℃、20 min），取上清液用双缩脲法测定其蛋白含量。

总蛋白质溶解性：取1 g肉样加入50 mL离心管中，加入20 mL经预冷的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.2），其中含有1.1 mol/L碘化钾溶液，冰浴条件下10 000 r/min匀浆30 s，匀浆2～3 次，4 ℃振荡抽提12 h。然后进行离心处理（1 500 r/min、4 ℃、20 min），将上清液用双缩脲法测定其蛋白含量。肌原纤维蛋白溶解性按式（1）计算：

1.3.6 离心损失

参考Zhang Wangang等[17]的方法并稍作修改。将宰后成熟0～72 h的肉样分别切成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的长条形，称其质量m1，放入10 mL离心管中，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，弃上清液，吸取表面水分称其质量m2，按式（2）计算离心损失率W：

1.4 数据统计分析

各项指标至少重复3 次。数据全部采用Microsoft Excel 2010计算±s，用SPSS 21.0进行Duncan差异显著性分析（P＜0.05，差异显著），Origin 9.0制图。

2 结果与分析

2.1 NOS活性、NO含量测定结果

动物宰后，肌细胞会在缺血、缺氧等应激条件下激活NOS产生NO[18]。由图1A可知，随着宰后成熟时间的延长，NOS活性呈减小趋势，对照组0 h NOS活性低于DETA组28.36%，高于L-NAME组52.24%。0、6、12 h对照组NOS活性显著高于L-NAME组（P＜0.05），显著低于DETA组（P＜0.05）。由图1B可知，DETA组NO含量先增大后减小，在6 h达到最大，6 h对照组低于DETA组13.75%，高于L-NAME组12.5%。6、12 h对照组NO含量显著高于L-NAME组（P＜0.05），显著低于DETA组（P＜0.05）；6、12、24、48、72 h DETA组NO含量显著高于L-NAME组（P＜0.05）。以上结果说明宰后牛肉成熟过程中DETA处理提高了牛肉的NO水平，L-NAME能够抑制NOS活性从而降低NO含量。Li Yunpin等[19]研究NO对宰后猪肉蛋白质的影响时使用DETA和L-NAME分别促进NO释放和抑制NOS活性，本实验结果与之一致。

图1 宰后成熟过程中NOS活性和NO含量的变化Fig.1 Changes in NOS activity and NO content during postmortem aging

2.2 AMPK活性和肌肉糖酵解水平分析

AMPK与宰后机体能量代谢有着密切联系，是能量稳态重要的感受器和调节器，AMPK活性的高低可以影响宰后糖酵解的速度和程度[20]。由表1可知，随着成熟时间的延长，3 个处理组的AMPK活性先增大后减小。AMPK活性在0、6、12 h对照组显著高于L-NAME组（P＜0.05），显著低于DETA组（P＜0.05）。L-NAME组在0 h AMPK活性分别低于对照组和DETA组17%、27%，在72 h分别低于对照组和DETA组8%、15%。Zhang Junhua等[21]研究，将静脉内皮细胞暴露于NO供体，增加了内皮细胞中AMPK Thr-172磷酸化水平和AMPK活性；James等[22]报道，血管内皮生长因子在Ser1177位点磷酸化或激活内皮细胞NOS可以促使NO产生，从而诱导激活AMPK。本研究AMPK活性L-NAME组低于对照组和DETA组与之类似，说明宰后牛肉成熟前期NO对AMPK有激活作用，但是具体的激活途径还需进一步研究。

表1 宰后成熟过程中AMPK活性和糖酵解酶活性的变化Table 1Changes in AMPK activity and glycolytic enzyme activity during postmortem aging

大量研究表明AMPK被激活后可以促进糖酵解的发生，其主要方式是调控糖酵解中的关键酶[1]。由表1可知，随着成熟时间延长HK活性降低，PFK活性先增大后减小，2 种酶活性在6、12 hL-NAME组显著低于对照组和DETA组（P＜0.05）。HK活性在0 h为最大值，PFK活性在6 h达到最大值，总体的PFK达到活性最大值的时间比HK延迟了6 h左右，推测原因可能是PFK是由HK的某些反应产物激活，这与Holmes等[23]的结果相一致，在老鼠骨骼肌中注射AMPK激活剂，显著提高了HK活性进而加速了糖酵解进程。此外，DETA+Compound C组HK活性和PFK活性在0、6、12 h显著低于其他3 组（P＜0.05），用Compound C抑制AMPK活性后，糖酵解速率也会受到抑制[24]。从表1可以看出，PK、LDH活性均呈下降趋势，但L-NAME组和DETA组与对照组均无显著差异（P＞0.05）。以上4 种酶活性的变化表明，牛肉宰后成熟早期NO通过调控AMPK活性影响糖酵解速率，在这一过程中HK和PFK是AMPK促进糖酵解速率的关键酶。

动物宰后糖酵解速率和程度是影响机体pH值的主要因素。pH值是评价肉品质的重要指标，pH值的变化能直接反映出宰后机体的能量代谢情况，会影响肌肉蛋白特性进而影响肉质[25]。由图2可知，随着成熟时间的延长，L-NAME组、对照组和DETA+Compound C组的pH值均呈减小趋势，但是DETA组pH值先减小后增大，在48 h提前降到最低点5.25，下降速率最大。在6、12、24 h，L-NAME组pH值显著高于对照组和DETA组（P＜0.05），推测原因是L-NAME抑制NO释放对AMPK的激活作用减弱，减慢糖酵解速率，使得pH值高于对照组和DETA组。杨雅媛等[26]发现宰后牦牛肉成熟过程中AMPK活性最大，糖酵解速率最快，乳酸质量浓度最大，pH值最低。DETA+Compound C组在6、12、24 h显著高于其他3 组（P＜0.05），进一步证明NO是通过激活AMPK促进糖酵解速率降低pH值。以上结果说明宰后牛肉成熟前期NO可以提高AMPK活性加速糖酵解使肌肉pH值降低。

图2 宰后成熟过程中pH值的变化Fig.2 Changes in pH during postmortem aging

2.3 蛋白溶解性和牛肉离心损失分析结果

动物宰后肌肉中蛋白溶解性是蛋白变性的重要指标之一，与pH值和保水性紧密联系。蛋白溶解性越高，蛋白结合水的能力就越强，肉的保水性也越好。由图3A可知，随着宰后成熟时间延长，总蛋白溶解性降低，0、6、12、24、48、72 hL-NAME组显著高于对照组（P＜0.05），6、12、24、48、72 h DETA+Compound C组显著高于其他3 组（P＜0.05）；图3B中肌原纤维蛋白溶解性降低，6、12、24 hL-NAME组显著高于对照组（P＜0.05），DETA+Compound C组显著高于其他3 组（P＜0.05），推测原因可能是NO激活AMPK促进糖酵解使得pH值降低，低pH值导致蛋白质变性使其溶解性降低。图3C肌浆蛋白呈增大趋势，0、6、12、24、48、72 hL-NAME组显著高于对照组（P＜0.05），可能是因为宰后短时间内肉样的pH值变化，使得肌浆蛋白重链发生部分伸展和重新折叠，部分表面疏水基团暴露和伸展，导致其界面活力增加，乳化能力提高，溶解度增加[27]。牛肉宰后相同成熟时间点上，L-NAME组总蛋白溶解性大于对照组，DETA+Compound C组总蛋白溶解性大于L-NAME组和对照组，由此可见，NO通过AMPK促进糖酵解进而影响pH值和蛋白溶解性。

图3 宰后成熟过程中蛋白溶解性的变化Fig.3 Changes in protein solubility during postmortem aging

离心损失作为衡量肉品持水力的重要指标之一，受pH值和蛋白溶解性变化的影响[28]。图4中离心损失呈先增大后减小趋势，6、12、24、48 hL-NAME组显著低于对照组和DETA组（P＜0.05），DETA+Compound C组显著低于其他3 组（P＜0.05），这种差异可能是宰后早期NO提高AMPK活性加速糖酵解使得pH值降低，变性蛋白溶解性下降进而导致离心损失增大。当蛋白质受低pH值影响变性后，特别是维持细胞骨架的连接蛋白变性会导致汁液损失增大[29]。pH值降低至蛋白等电点后，蛋白质的正负电荷相等，蛋白质相互吸引，静电荷为零，降低了对水分的吸引，也会造成水分流失。Joo等[16]探讨猪背最长肌蛋白溶解性与其保水性之间的关系，发现pH值越低蛋白溶解性越小，保水性越差。牛肉宰后相同成熟时间点，离心损失L-NAME组低于对照组，DETA+Compound C组低于L-NAME组和对照组，说明NO通过激活AMPK促进糖酵解速率加快与乳酸积累，pH值下降使蛋白质变性，导致肉的离心损失变大，持水性变差。

图4 宰后成熟过程中离心损失的变化Fig.4 Changes in centrifugal loss during postmortem aging

2.4 相关性分析

由表2可知，L-NAME组AMPK活性变化与NO含量呈显著正相关（P＜0.05），DETA组和对照组AMPK活性变化与NO含量呈极显著正相关（P＜0.01）。Higaki等[30]用NO供体对大鼠骨骼肌处理增加了AMPK活性，证明NO含量与AMPK活性呈正相关关系；HK活性变化、PFK活性变化、L-NAME组和对照组pH值与AMPK活性变化表现为极显著正相关（P＜0.01），DETA组pH值与AMPK活性呈显著正相关（P＜0.05）。AMPK活化后可以促进糖酵解[31]，Du Min等[32]报道宰后AMPK会加速糖酵解使肌肉的pH值快速下降；总蛋白溶解性与pH值呈极显著正相关（P＜0.01），离心损失与总蛋白溶解性和pH值分别呈极显著负相关（P＜0.01）。有研究表明汁液损失与蛋白变性呈显著负相关[33]，在牛克兰等[34]的研究中汁液损失与pH值呈负相关，而总蛋白溶解性与pH值为正相关关系。推测原因是NO激活AMPK增强HK、PFK活性促进糖酵解速率，乳酸累积，pH值降低，蛋白质变性，使其溶解性下降进而导致汁液损失率增大[35]。宰后pH值降低是肉的保水性变差的主要原因，Melody等[36]研究显示pH值的变化会引起蛋白质变性导致水合能力下降，肌肉保水能力随之下降。结果表明，NO可以提高AMPK活性促进糖酵解速率使pH值下降，导致蛋白质变性溶解度降低，最终使肉的离心损失增大持水力下降。

表2 各指标间的Pearson相关系数（r）Table 2Pearson correlation coefficients (r) among various indicators and significance test

3 结 论

受宰后僵直作用的影响，在宰后成熟72 h前牛肉的持水能力降低。然而，在此阶段肌肉中的NO促进了AMPK的激活，活化的AMPK通过增强HK和PFK活性加快糖酵解速率进一步使pH值快速降低，导致肌肉的pH值过早接近蛋白质等电点而降低了蛋白质的溶解性和肌肉的持水能力。因此，可以将NO对AMPK的调节途径作为一个重要的调控靶点，并以此改善牛肉在成熟过程中的持水能力和肉品质。