高瑞平，梁 琪*，白莉莉

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃 兰州 730070）

干酪生产过程中会产生副产物乳清废液[1]，而废液中的乳清蛋白是一种营养价值极高、具有多种功能特性的蛋白源[2]。这种生产干酪得到的乳清称为甜乳清，另一种通过酸沉淀得到的乳清称为酸乳清，也称原乳清。商业化乳清蛋白产品主要以乳清蛋白浓缩物（whey protein concentrate，WPC）和乳清蛋白分离物（whey protein isolation，WPI）为主，超滤是目前用于生产WPC和WPI的核心技术手段，可以制备出不同蛋白含量的产品[3]。WPC由于其具有较好的功能特性，例如乳化性、起泡性等，已成为现代食品加工中重要的蛋白来源[4]。

国内外学者对各类WPC的功能特性进行了相关研究。Heino等[5]对原乳清蛋白浓缩物（native whey protein concentrate，NWPC）和甜乳清蛋白浓缩物（sweet whey protein concentrate，SWPC）功能特性的研究结果表明，干燥方式对WPC功能特性无显著影响，SWPC溶解性、持水性和乳化性较好。Svanborg等[6]研究通过膜处理原乳清液得到WPC的起泡性和乳化性，结果表明，原乳清液可能是生产WPC的潜在来源，具有与通过干酪生产获得的WPC相同的组成和功能性质。早期有学者对乳清蛋白纯品以及乳清蛋白混入其他体系后乳化性进行研究[7]，结果表明决定其乳化特性的重要因素是蛋白质浓度、pH值、离子强度、钙和乳糖浓度，以及加工条件和储存条件[8]。Gazi等[9]对蛋白质质量分数在35%～87%的WPC的溶解性研究结果表明，WPC具有较好的溶解特性，随着蛋白含量增加，溶解性也随之提高。Sodini等[10]研究pH值和热处理对酸奶中WPC功能特性的影响，结果表明热处理的WPC可以提高酸奶的持水性能。

在工业生产过程中的热处理环节，牛乳蛋白的物化性质及分子结构都会发生相应改变，从而影响产品质量，主要是由于在70 ℃以上温度加热时，引起乳清蛋白的热变性，特别是β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）与κ-酪蛋白形成二硫键发生聚合附着在胶束表面[11]。杨楠等[12]研究对比了牦牛脱脂乳、纯酪蛋白溶液经过不同温度（30～90 ℃）的热处理，两者相关功能特性（热稳定性、乳化性）的变化。结果表明随着热处理温度的上升，由于乳清蛋白与酪蛋白的相互作用及酪蛋白自身发生离解、聚集过程，导致脱脂乳和酪蛋白溶液的热稳定性下降、乳化性降低、浊度增大。

牦牛乳是青藏高原地区的优质乳源，近年来，随着我国牦牛乳乳品企业的相继建立，在加大乳产量的同时，产生的乳清废液的利用管理成为牦牛乳品企业面临的一大难题。目前市售荷斯坦牛乳的WPC产品，蛋白含量越高，价值也越高，广泛应用于婴儿配方奶粉、酸奶以及健身食品中，尤其婴儿配方奶粉需要高蛋白含量的WPC，我国还依靠国外进口为主。对牦牛WPC的功能特性分析具有很高的研究价值。本实验对不同截留分子质量膜处理获取的牦牛WPC溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性等功能特性进行系统性比较研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牦牛乳采自甘肃天祝县抓喜秀龙乡。所有有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SP-723紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；SH220N石墨消解仪 济南海能仪器有限公司；SKD-200凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司；SCIENTZ-10ND冷冻干燥机、XHF-D高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；QL-866旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；L500医用离心机 湘仪离心机仪器有限公司；WTM-1812G卷式膜设备 杭州沃腾膜工程有限公司；再生纤维素RC型透析袋 上海源叶生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳主要成分及理化指标测定

蛋白质：参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法；乳脂肪：GB 5413.3—2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪测定》中盖勃氏乳脂计法测定；乳糖：SN/T 0871—2012《出口乳及乳制品中乳糖的测定》中的分光光度计法；酸度：pH计进行测定。

1.3.2 样品制备

1.3.2.1 牦牛乳NWPC的制备

采用陈婷[13]和Macedo[14]等的方法作适当修改。鲜牦牛乳10 000 r/min离心30 min脱脂，调节pH 4.6等电点沉淀，3 500 r/min离心20 min，收集上清液，即为原乳清液，经截留分子质量3 500 Da的卷式膜超滤浓缩得到NWPC，直接真空冷冻干燥制取的粉制品即为NWPC1；浓缩液经5 000 Da的透析袋透析过夜，冻干得到NWPC2；浓缩液经10 000 Da的透析袋透析过夜，冻干得到NWPC3。

1.3.2.2 牦牛乳SWPC的制备

在实验室条件下手工制作牦牛乳硬质干酪生产过程中收集的乳清废液，经截留分子质量3 500 Da的卷式膜超滤浓缩得到SWPC，直接真空冷冻干燥制取的粉制品即为SWPC1；按照NWPC2和NWPC3相同步骤分布制取SWPC2、SWPC3。

1.3.3 WPC主要成分测定

蛋白质：参考GB 5009.5—2016中凯氏定氮法；乳糖：参考SN/T 0871—2012中的分光光度计法；酸度：pH计进行测定。

1.3.4 WPC功能指标测定

1.3.4.1 持水性和持油性的测定

采用Palatnik等[15]的方法作适当修改。持水性：用预先称量过的离心管准确称取2.0 g样品，缓慢加水，每加几滴水，用旋涡混合器混合几分钟，直至样品呈浆状且无水析出时为止，于10 000 r/min离心3 min，倒去上层清液，称量。离心后若无上清液，再加水搅匀离心，直至离心后有少量上清液为止。持水性表示每克样品中吸收水并保持水的质量，计算公式如下：

式中：m1为空试管的质量/g；m2为试管加样品的质量/g；m3为沉淀物加试管的质量/g。

持油性：1 g（精确到0.001 g）样品溶于含25 mL大豆色拉油的离心管，用旋涡混合器混合30 s。油混合物在4 200 r/min离心30 min。测定分离出的油体积，持油性表示为每克蛋白质样品吸收油的体积，计算公式如下：

式中：V0为25 mL；V1为离心出油的体积/mL；m为样品质量/g。

1.3.4.2 乳化性的测定

采用Pearce等[16]的方法作适当修改。取0.02 g/mL样品溶液21 mL，边搅拌边加入纯大豆色拉油9 mL，然后以10 000 r/min高速匀浆1 min制成乳状液，乳状液放置10 min，从玻璃容器底部取100 μL乳化液加入到5 mL、0.1%的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中混匀，利用紫外-可见分光光度计于波长500 nm处测吸光度，用0.1%的SDS溶液为空白调零。乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定指数（emulsifying stability index，ESI）计算公式如下：

式中：C为样品溶液浓度；φ为油相所占的体积分数（2%）；A500nm为500 nm波长处的吸光度；D为样品稀释倍数；A0为0时刻的吸光度；A10为10 min后的吸光度。

1.3.4.3 起泡性的测定

采用Motoi等[17]的方法作适当修改。取40 mL 0.02 g/mL的样品，用内切式高速分散器在10 000 r/min搅打1 min，快速将泡沫转移至量筒中，测量搅打后的泡沫体积和静置10 min的泡沫体积。起泡能力用经搅打后蛋白质分散物的体积增加量表示。泡沫稳定性按下式计算：

式中：V0为搅打后泡沫的体积/mL；V10为放置10 min后的泡沫体积/mL；V为搅打前样品溶液的体积/mL。

1.3.4.4 溶解性的测定

采用Luo等[18]的方法作适当修改。配制0.05 g/mL的乳清蛋白溶液，25 ℃恒温振荡1 h，10 000 r/min离心5 min，得上清液。用凯氏定氮法测定上清液的蛋白含量，每个样品重复实验3 次，溶解性按下式计算：

1.3.4.5 热稳定性的测定

采用Meng等[19]的方法作适当修改，测定依据是在热处理时蛋白在溶液中的溶解程度。将质量浓度为0.02 g/mL的乳清蛋白溶液分别在60、65、70、75、80、85、90、95 ℃水浴加热30 min。取出后立即冰浴2 min，恢复至室温。然后称取热处理后的溶液于2 500 r/min离心10 min，倒出上层溶液，称取下层沉淀物质量，计算比较沉淀量与蛋白溶液的比例。沉淀量越大，稳定性越差。沉淀率计算公式如下：

1.4 数据统计

数据采用Origin 8.0与SPSS 17.0软件进行处理，采用Duncan多重比较方法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 牦牛乳主要成分含量及理化指标分析

由表1可看出，牦牛乳蛋白含量和脂肪含量较高，其pH值约为6.55。

表1 牦牛乳中主要成分含量及理化指标Table 1Major components and physicochemical characteristics of yak milk

2.2 牦牛WPC主要成分分析

根据膜对不同蛋白质分子质量的截留程度选择性过滤乳糖、矿物质、水分和低分子质量化合物等物质[20]。由表2可知，经同一膜处理的牦牛WPC乳糖含量无显著差异（P＞0.05），pH值差异显著（P＜0.05），蛋白质含量差异显著（P＜0.05），牦牛NWPC1、NWPC2、NWPC3总蛋白质量分数分别为14.708%、31.778%、81.432%，牦牛SWPC1、SWPC2、SWPC3总蛋白质量分数分别为22.905%、38.680%、84.898%，经10 000 Da膜截留得到的牦牛NWPC3蛋白含量约为NWPC1的5.5 倍，NWPC2的2.6 倍，牦牛SWPC3蛋白含量约为SWPC1的3.7 倍，SWPC2的2.2 倍。Alsaed等[21]研究指出，产生这种蛋白差异主要原因是牦牛甜乳清液通过生产酶凝型硬质干酪获得，添加的凝乳酶促进凝乳，凝乳酶切割κ-酪蛋白的Phe105-Met106键，产生p-κ-酪蛋白和糖巨肽，p-κ-酪蛋白附着在酪蛋白胶束的表面进入干酪中，而糖巨肽则留在乳清液中，因此经同一规格膜处理的牦牛SWPC总蛋白含量高于牦牛NWPC总蛋白含量；不同膜处理的牦牛WPC其乳糖含量、蛋白含量存在显著性差异（P＜0.05），随着膜截留分子质量的增大，牦牛WPC乳糖呈显著下降（P＜0.05），WPC3中均不含乳糖，蛋白质含量呈现上升的趋势，说明蛋白纯化效果显著。

表2 WPC主要成分Table 2 Major components of WPCs

2.3 牦牛WPC溶解性分析

由图1可知，随着处理膜截留分子质量的增大，牦牛WPC的溶解性随之增高，这主要因为随着截留分子质量的增加，牦牛WPC蛋白质含量升高。De Castro-Morel等[22]研究得，同一pH值条件下，蛋白质含量的高低影响荷斯坦牛乳WPC的溶解性，WPC80的溶解性显著高于WPC35。牦牛NWPC和SWPC的溶解性差异显著（P＜0.05），用3 500 Da卷式膜和5 000 Da再生纤维素膜过滤得到的牦牛NWPC溶解性高于牦牛SWPC，这主要的原因是牦牛SWPC使用的干酪乳清液在制作干酪过程中经过了热处理环节。有学者对荷斯坦牛乳蛋白粉的相互作用研究表明[23]，热处理导致乳清蛋白和酪蛋白发生不同程度的聚集，聚集物主要是乳清蛋白和κ-酪蛋白之间以二硫键形式结合，形成酪蛋白胶束，使得乳蛋白粉溶解性降低，影响乳蛋白粉功能特性。该研究结果也阐明牦牛NWPC和牦牛SWPC在溶解性上的差异。用10 000 Da再生纤维素膜透析得到的牦牛WPC因其纯度均较高，溶解性显著增高，牦牛SWPC的溶解性显著高于牦牛NWPC的溶解性，说明乳清蛋白含量越高，溶解性越高。

图1 牦牛WPC的溶解性Fig.1 Solubility of yak WPCs

2.4 牦牛WPC持水性分析

由图2可知，3 种不同截留分子质量膜处理获得的牦牛NWPC持水性显著高于SWPC，有研究报道[4]热处理可以降低蛋白质和水的结合能力，同时因乳清蛋白是热敏性蛋白，部分乳清蛋白变性聚集，降低了蛋白质和水的结合能力，从而降低了蛋白质的持水性能，外部因素对WPC内部结构和聚集状态的影响同时决定其功能特性的变化[24]。随着处理膜截留分子质量的增大，牦牛WPC持水性呈现显著上升的趋势，蛋白质含量的增高导致蛋白质-水作用增强，从而使得持水性增强。持水性是乳产品经常被需求的一种功能特性，工业上利用乳清蛋白的持水性能将其应用于肉类食品中，以提高肉类产品的保水性[25]。

图2 牦牛WPC的持水性Fig.2 WHC of yak WPCs

2.5 牦牛WPC持油性分析

由图3可知，3 500 Da卷式膜和5 000 Da再生纤维素膜过滤得到的牦牛NWPC和SWPC间无显著差异（P＞0.05）；随着处理膜截留分子质量的增大，牦牛WPC持油性显著增高；蛋白质的吸油性是指蛋白质在一定加工条件下保持油脂的能力，是蛋白质的功能特性之一，乳清蛋白常作为脂肪类似物应用在肉类、焙烤食品中，WPC良好的持油性和持水性能对改善食品口感，包括硬度、黏度等物性指标有重要意义，有利于完善组织化产品的感官品质和功能品质[26]，同时这也是WPC的商业利用途径之一。

图3 牦牛WPC的持油性Fig.3 OHC of yak WPCs

2.6 牦牛WPC起泡能力和泡沫稳定性分析

由图4可知，牦牛NWPC和SWPC起泡能力存在显著差异（P＜0.05），Kamath等[27]研究不同处理温度下荷斯坦牛乳脱脂乳泡沫界面物质组成的结果指出WPC在生产乳清液环节之前，牛乳经过巴氏杀菌处理，形成酪蛋白胶束，胶束和变性的乳清蛋白以二硫键结合，分散在气泡表面，增强WPC的起泡能力。牦牛SWPC起泡能力显著高于NWPC。随着获得的牦牛WPC蛋白含量的增高，起泡能力呈现显著增高的趋势，这与界面分散更多的蛋白分子有关，因此，高蛋白含量的牦牛WPC起泡能力较好。牦牛WPC泡沫稳定性随着蛋白质含量的升高，变化趋势和牦牛WPC起泡能力一致，该现象与有学者研究的不同物质对荷斯坦牛乳脱脂乳起泡性能改善的结果一致[28]，说明随着牦牛WPC浓度的升高，泡沫稳定性表现显著增强的效果。

图4 牦牛WPC的起泡能力和泡沫稳定性Fig.4 Foam capacity and stability of yak WPCs

2.7 牦牛WPC乳化活性和乳化稳定性分析

由图5可知，牦牛NWPC1和牦牛SWPC1有显著差异（P＜0.05），随着处理膜截留分子质量的增大，牦牛WPC的EAI呈现显著增强的趋势（P＜0.05），牦牛WPC的EAI增加趋势和蛋白含量增加趋势一致。牦牛SWPC的ESI显著高于NWPC，差异主要来源于牦牛SWPC经过热处理，Dybowska[29]对荷斯坦牛乳WPC研究结果表明，WPC经过不同条件下的热处理，会发生不同程度的聚集行为，可能会产生稳定的纳米颗粒和聚集体，聚集蛋白可能已经形成了较厚的蛋白质膜，因此这些小聚集体都可以稳定乳液；当蛋白液浓度增高时，分散相黏度较高，使脂肪流动最小化，从而延迟了乳化过程。当蛋白浓度越高时，不但增加了乳液的黏度，而且为脂滴涂布提供了更多的蛋白质，因此其ESI增高[30]。这和牦牛WPC的ESI变化趋势一致，可以作为牦牛WPC的ESI变化的理论解释。

图5 牦牛WPC的EAI和ESIFig.5 EAI and ESI of yak WPCs

2.8 牦牛WPC热稳定性分析

由图6可知，牦牛WPC在60 ℃时均有沉淀产生，说明在60 ℃热处理30 min牦牛WPC开始变性。牦牛NWPC2、NWPC3、SWPC2和SWPC3在70 ℃以上，沉淀率显著增大（P＜0.05），85 ℃沉淀率最大，NWPC3、SWPC3沉淀率分别为0.424%、0.409%，85～95 ℃，沉淀率变化缓慢；牦牛NWPC1和SWPC1沉淀率变化缓慢，在85 ℃达到最大沉淀率，当热处理温度高于85 ℃沉淀率变化缓慢（P＞0.05）。Dickow等[31]对荷斯坦牛乳WPC的研究发现，荷斯坦牛乳WPC在60 ℃开始变性，β-Lg开始聚集；当热处理温度增加至70 ℃时，β-Lg肽链展开，在80 ℃热处理时，β-Lg结构改变，开始变性，处理温度到90 ℃以后，β-Lg全部变性。Brodkorb等[32]研究发现，荷斯坦牛乳乳清蛋白在80 ℃时最不稳定，当热处理温度达90 ℃时，热稳定性趋于稳定，原因是α-La分子展开，疏水基团巯基大量暴露在分子表面，和变性β-Lg以二硫键交联形成胶束，而形成的胶束物质具有较好的热稳定性，热稳定性趋于稳定。这与本实验牦牛WPC热稳定性的变化趋势一致，但是实验结果发现牦牛WPC的最不稳定温度为85 ℃，高于荷斯坦牛乳WPC的80 ℃。牦牛SWPC1、SWPC2和SWPC3热稳定性显著高于牦牛NWPC1、NWPC2和NWPC3，说明加工干酪阶段的热处理会适当改善牦牛WPC的热稳定性。

图6 牦牛WPC的热稳定性Fig.6 Thermal stability of yak WPCs

3 结 论

不同截留分子质量膜生产得到不同蛋白含量的牦牛WPC主要成分和功能特性差异显著，10 000 Da透析膜得到的牦牛NWPC和SWPC总蛋白质含量均达到80%以上，且无乳糖残留，同时，其功能特性（溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性）均显著高于其他膜分离得到的牦牛WPC，说明10 000 Da透析膜生产的牦牛WPC纯度较高，其总蛋白含量高，功能特性突出，应用前景较好。获取不同蛋白含量的牦牛SWPC其起泡能力、泡沫稳定性、乳化活性、乳化稳定性和热稳定性均显著高于NWPC，说明热处理会适当改善牦牛WPC的起泡性能、乳化性能和热稳定性，从而拓宽牦牛WPC的应用范围；通过膜处理获取蛋白含量较高的牦牛WPC，功能特性较好，应用领域广泛，这对解决牦牛乳清资源的利用问题、保护环境、提高企业的经济效益起到关键性作用。