杨明柳，周迎芹，方旭波，殷俊峰，陈小娥,*，谢宁宁,*

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022；2.安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽 合肥 230031）

鳜鱼（Siniperca chuatsi），又名桂花鱼，肉质细嫩，味道鲜美，富含丰富的优质蛋白[1]，属于我国特色淡水鱼范畴。目前，鳜鱼加工品主要为冷冻臭鳜鱼和即食臭鳜鱼罐头[2-3]，产品种类比较单一。近年来，随着鳜鱼养殖技术的成熟、养殖产量逐年提高[4]，有调研报告指出2020年鳜鱼价格大幅下降[5]；因此，以鳜鱼为鱼糜生产原料，可以拓展鳜鱼产品市场，能保证品质要求，符合未来发展趋势。然而，淡水鱼与海水鱼相比，鱼糜凝胶特性较低[6]，需要借助食品技术手段进行品质改进。

谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG）是一种催化酰基转移的酶，可使蛋白质以及肽和各种伯胺之间发生交联。当蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体时，在蛋白质分子间和分子内交联生成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键，从而改善蛋白质的凝胶能力[7]。Chanarat等[8]研究表明鱼类肌肉蛋白质的组成和性质可能决定TG诱导的蛋白质交联方式，进而影响其凝胶的性质。尚永彪等[9]在苍白、松软、表面汁液渗出肉加工的重组肉制品中添加TG，增强其肉制品的凝胶强度，减少加工蒸煮损失。董建国等[10]研究发现超高压和TG结合处理碎牛肉，能够提高牛肉凝胶的咀嚼性和硬度等。严菁[11]研究表明鱼糜凝胶在添加10 U/g TG，并于42 ℃处理2 h后，凝胶强度较未添加组增加1 倍。因此，TG可以作为一种改进蛋白品质的良好备选，具有提高肉质口感和凝胶属性等优点。

已有研究探讨TG对鲢鱼、鲤鱼和鱿鱼凝胶特性的影响[8]，其改善鱼糜凝胶网络结构的作用受到国内外学者广泛关注。然而如何改善鳜鱼鱼糜凝胶的品质，基本处于理论摸索阶段。因此探究TG对鳜鱼鱼糜凝胶的品质影响，主要分析持水性、色泽、质构、感官评价变化、蛋白质二级结构、微观结构以及蛋白电泳的变化规律，旨在为鳜鱼加工基础理论提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鳜鱼购于安徽省池州市东至县大联圩农业开发有限公司；食盐 市购。

透析袋（MD34-5M） MYM Biological Technology公司；TG（100 U/g）、彩虹245广谱蛋白Marker 北京索莱宝科技有限公司；过硫酸铵、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、Acr/Bis 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二硫苏糖醇、甘氨酸、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、十二烷基硫酸钠 上海麦克林生化科技有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JYS-A800绞肉机 九阳股份有限公司；H1750R离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；CR-400色差分析仪 柯尼卡美能达控股公司；TA.XT Plus质构仪 英国Stable Micro System公司；PD-ICE冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司；IS5傅里叶红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；SU8010扫描电子显微镜 株式会社日立制作所；JY600C电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理及鱼糜凝胶制备

原料预处理：新鲜鳜鱼去皮去骨后置于料理机中，低速搅碎30 s，放入3 倍体积4 ℃预冷的蒸馏水中漂洗2 次，用2 层灭菌纱布拧干其中水分，控制水分含量最终一致[12]。

透析袋预处理：配制1 000 mL 1 mol/L的EDTA，用NaHCO3将溶液pH值调节为8，将透析袋置于pH值为8的溶液中煮沸10 min，冷却后用蒸馏水清洗。

热诱导鱼糜凝胶模型建立：建立半透膜模型，模拟鳜鱼湿法腌制过程[13]，研究鳜鱼发酵期间盐水逐渐渗透鱼肉的过程，构建鱼糜凝胶模型。如图1所示，称取100 g新鲜鱼糜放入料理机中加入TG（TG添加量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 U/g），低速斩拌30 s再高速斩拌30 s，促进鱼糜与TG充分接触进行反应。将搅碎的鱼糜灌入分子质量500 Da、直径34 mm的透析袋中，灌得的鱼肠长度均为25 cm左右，将透析袋两端密封后放入30 g/L的盐水中，使肠与盐水的比例为1∶4，之后放入4 ℃冰箱反应48 h。采用两段水浴加热方式进行热诱导，即40 ℃加热20 min使鱼糜凝胶化后，立即转入90 ℃水浴加热30 min使其熟化。

图1 半透膜模型Fig.1 Semipermeable membrane model simulating brine permeation during fermentation of mandarin fish

1.3.2 盐度测定

将鱼肠放入30 g/L盐水中，反应开始后按0、2、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h取样。将鱼肠从盐水溶液中取出，用手持式盐度计测定鱼肠盐度值，测定后将鱼肠放回盐水溶液中继续反应，直至48 h结束。

1.3.3 持水性测定

参考Yi Shumin等[14]方法，称取5 g鱼糜凝胶（m1，g），3 层滤纸包裹后放入50 mL离心管中，4 ℃、6 000×g离心10 min，离心后准确称质量（m2，g）。持水性按式（1）计算：

1.3.4 色泽测定

取出4 ℃存放的鱼糜凝胶样品室温下平衡1 h，切成高为1 cm左右的圆柱体。使用手持式色差仪测定鱼糜凝胶切面的L*值、a*值、b*值。按式（2）计算[15]：

1.3.5 质构分析

参考周迎芹等[13]的方法。将鱼糜凝胶样品在室温下平衡1 h，将其切成1 cm高的圆柱体，放在质构仪上测定硬度、弹性、黏聚性、胶黏性、咀嚼性、回弹性，使用直径35 mm的圆柱形探头（p/50）。具体参数设定：触发类型Auto（Force）、触发力5.0 g，测试前速率1.0 mm/s，测试中速率5.0 mm/s，测试后速率5.0 mm/s，变形量10 mm。

1.3.6 傅里叶红外光谱测定

参考Moreno等[16]的方法。将鳜鱼鱼糜凝胶样品冷冻干燥，称取1～2 mg试样与200 mg溴化钾研细均匀，置于模具中，在油压机上压成透明薄片，将样品放入红外光谱仪中测试，范围4 000～400 cm－1，扫描次数32，分辨率4 cm－1。

1.3.7 扫描电子显微镜观察

参考Kudre等[17]的方法取对照组和TG添加量为0.6 U/g鱼糜凝胶，切成2～3 mm厚的小块，经2.5%戊二醛4 ℃固定过夜，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗3 次，每次15 min；再经1%锇酸溶液4 ℃固定1 h，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗3 次，每次15 min；然后依次用体积分数30%、50%、70%、80%和90%的乙醇溶液进行梯度脱水，各梯度脱水时间均为15 min，最后再经无水乙醇脱水30 min。冷冻干燥，镀膜后置于扫描电子显微镜下观察。

1.3.8 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

参考杨慧[18]的方法提取肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和基质蛋白。分别吸取蛋白提取液加入上样缓冲液，98 ℃水浴加热10 min，5 000 r/min离心2 min。选用15%分离胶和5%浓缩胶进行电泳，电泳全程电压为250 V，待溴酚蓝到达底部时结束。用蒸馏水洗涤3 次，置于摇床上用考马斯亮蓝-R250过夜染色。乙醇-醋酸脱色液脱色4～6 h，于凝胶成像系统中采集图像。

1.3.9 感官评定

将鳜鱼鱼糜凝胶切成1 cm厚度的圆柱体，置于一次性塑料碗中，邀请10 名食品专业学生组成评定小组，主要对色泽、气味、组织状态和表观特征进行评判，每项指标的得分及评定标准见表1[19]。

表1 感官评定标准Table 1Criteria for sensory evaluation of mandarin fish surimi

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 反应时间对鳜鱼鱼糜盐度的影响

食盐含量的变化反映鱼糜的形成过程，明确主要时间节点是构建半透膜模型的重要依据之一。本研究新鲜鳜鱼经漂洗后的初始盐度值为0.09%，随着反应时间的延长，盐度发生规律性变化。由图2可知，4～24 h期间，盐度随着时间的变化较大，第24小时盐度达到1.02%；在24～36 h期间，盐度缓慢增加，反应到第36小时盐度达到最大值，随后稍有下降，最终趋于平缓。因此，本研究选取反应48 h的鱼糜凝胶测定各指标变化。

图2 不同反应时间鳜鱼鱼糜盐度的变化Fig.2 Change in salinity of S.chuatsi surimi during reaction process

2.2 TG添加量对鳜鱼鱼糜凝胶持水性的影响

持水性能够反映蛋白质的结合水能力，可以直观评价鱼糜的质量和品质[20]。由图3可以看出，与对照组相比，添加TG后鱼糜持水性降低，说明TG催化蛋白质交联，使鱼糜基质结构更紧密，因此通过离心从鱼糜凝胶网络中排出更多的水[21]。当TG添加量为0.2 U/g和0.4 U/g时持水性偏低，这是由于凝胶基质中存在未结合的过量水，在经过离心后被释放出来[22]。随着TG添加量的增加持水性呈阶段性变化，相比于较低添加量的TG来说，持水性上升，其中添加量为0.6 U/g时持水性达到86.27%。这是因为TG催化蛋白交联形成ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸共价结合键，使鱼糜凝胶形成更牢固的三维网络，从而更大限度地包容大量水分。

图3 TG添加量对鳜鱼鱼糜凝胶持水性的影响Fig.3 Effect of TG addition on WHC of S.chuatsi surimi gel

2.3 TG添加量对鳜鱼鱼糜色泽的影响

色泽是微生物学和生物化学变化的外部表现[23]，是影响消费者可接受程度的重要指标之一。由图4可知，添加TG后，L*值、a*值和b*值显著上升（P＜0.05），可能是因为TG与蛋白质交联后，凝胶基质中释放的水产生的光色散效应有关，与对照组相比较，经TG处理后白度值增加，随着TG添加量的增加白度无显著变化（P＞0.05），这与Chanarat等[8]研究结果一致，表明TG的添加通常对所得鱼糜凝胶的白度没有显著影响。

图4 TG添加量对鳜鱼鱼糜凝胶色泽的影响Fig.4 Effect of TG addition on color of S.chuatsi surimi gel

2.4 TG添加量对鳜鱼鱼糜质构的影响

质构特性是评价鱼糜凝胶感官品质的重要参数，能间接反映出蛋白基质的结构完整性及与其他成分相结合的状态[24]。由图5可以看出，随着TG添加量的增加，鱼糜凝胶硬度显著增大（P＜0.05）。当TG添加量为0.2 U/g时与对照组差异不显著（P＞0.05），添加量为0.4、0.6、0.8、1.0 U/g时硬度显著高于对照组（P＜0.05），硬度分别达到了14 408、16 573、16 697、19 094 g。从弹性变化趋势看，随着TG添加量的增加弹性呈上下往复变化，总体较对照组有所提高，但差异不显著（P＞0.05）。添加TG以后，能够提高鱼糜凝胶的硬度和弹性，这可能是因为在加热过程中蛋白高级结构的舒展，疏水基团暴露出来，蛋白分子间发生交联形成更加稳定致密的三维凝胶网络[25]。

图5 TG添加量对鳜鱼鱼糜凝胶质构的影响Fig.5 Effect of TG addition on texture of S.chuatsi surimi gel

黏聚性表示在探头与样品接触时用以克服两者表面间吸引力所必需的总功。胶黏性表示咀嚼半固体食品至可吞咽状态时所需要的能量，数值上用硬度和黏聚性的乘积表示。与对照组相比，当TG添加量为0.2 U/g时黏聚性提高55%，鱼糜凝胶黏聚性的增大可能是TG催化蛋白发生交联使肌球蛋白尾部通过尾对尾相互作用发生连接，从而产生永久性的线和丝状凝胶网络结构造成的[26]。TG添加后胶黏性显著提高（P＜0.05），说明添加TG能够增大鱼糜凝胶内部的黏合力[27]。TG添加量为0.8 U/g和1.0 U/g时胶黏性较0.6 U/g处理组显著上升（P＜0.05），Duangmal等[28]发现添加0.3 U/g TG可提高凝胶的黏性，考虑到吞咽时口感问题，0.6 U/g是较适合的TG添加量。

回弹性表示样品形变的外力撤除后，物体迅速恢复原来形状的能力。添加TG后鱼糜凝胶的咀嚼性和回弹性均显著提高（P＜0.05），说明添加TG使凝胶结构更加均一紧密，可以明显改善鱼糜凝胶的品质。当TG添加量为0.8 U/g时两者数值降低，可以看出咀嚼性和回弹性有良好的相关性。TG添加量为0.2～0.6 U/g时咀嚼性和回弹性呈上升趋势，继续增加TG添加量两者指标上下浮动，较0.6 U/g添加量变化不显著（P＞0.05）。说明添加0.6 U/g TG足够达到鱼糜凝胶较为理想的品质。

2.5 傅里叶红外光谱分析

蛋白质二级结构是指肽链主链骨架原子的空间构象，不涉及氨基酸残基侧链的空间排列，二级结构的变化很大程度上决定了蛋白质的功能特性[29]。由图6可以看出，添加不同量TG的傅里叶红外光谱中吸收峰的位置差异较小，但特征峰形存在一定变化。酰胺I带（1 600～1 700 cm－1）与C＝O或C＝N的伸缩振动有关，通常用来分析蛋白质的二级结构，其中1 600～1 640 cm－1属于β-折叠，1 640～1 650 cm－1属于无规卷曲，1 650～1 660 cm－1属于α-螺旋，1 660～1 695 cm－1属于β-转角。选择酰胺I带进行去卷积、二阶求导处理，并作高斯曲线拟合得到蛋白质二级结构的相对含量变化[30]。

图6 鳜鱼鱼糜凝胶蛋白的红外光谱分析Fig.6 FTIR spectra of proteins in S.chuatsi surimi gel

由图7可知，鱼糜凝胶中无规卷曲含量很少，与对照组相比，鱼糜凝胶样品在TG添加量为0.4、0.8、1.0 U/g时，无规卷曲相对含量变为0%，α-螺旋相对含量依次减少了6.23%、8.53%、6.69%，β-折叠相对含量增加了7.69%、7.07%、11.28%，这可能是肌球蛋白发生溶解、展开、聚集，使α-螺旋部分转化为无规卷曲和β-折叠[7]。α-螺旋相对含量降低，表明蛋白质分子展开，疏水基团暴露[31]；β-折叠相对含量增加，说明蛋白质分子间聚集程度增加，从而提高鱼糜凝胶强度。α-螺旋相对含量减少通常会导致持水性的降低，通过观察α-螺旋含量变化可以反映持水性的变化，这与测得的持水性变化趋势基本一致。β-转角为蛋白质分子的无序结构，随着TG添加量的增加其含量没有较大变化，说明TG的加入没有改变β-转角结构。

图7 TG添加量对蛋白质二级结构含量的变化Fig.7 Effect of TG addition on protein secondary structure content

2.6 扫描电子显微镜分析

蛋白凝胶的三维网状结构是影响鱼糜质地特性的重要因素。如图8所示，根据持水性和质构等指标分析，选择TG添加量为0.6 U/g鱼糜凝胶观察微观结构。未添加TG处理组形成的凝胶网络松散无规则，空隙大小不一且分布不均匀，而添加TG处理后凝胶网络结构更为紧密，孔洞较小，分布有序，这是因为TG交联形成大量多聚体促进三维网状结构更加稳定[32]。Trespalacios等[33]研究TG对鸡肉凝胶微观结构的影响也得到类似的结论。

2.7 SDS-PAGE结果

如图9所示，鳜鱼鱼糜肌原纤维蛋白主要的条带有肌球蛋白重链（220 kDa）、肌动蛋白（43 kDa）、原肌球蛋白（36 kDa）、2 条肌球蛋白轻链（17、19 kDa）[34]。肌球蛋白重链带、原肌球蛋白带随TG添加量的增加逐渐减弱，添加量为1.0 U/g时几乎不可辨别，表明肌球蛋白重链通过TG的催化作用形成了ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键，进而提高鱼糜凝胶的硬度和弹性指标。与对照组相比，加入TG后肌动蛋白带有一定程度的减弱，继续增加TG添加量不会影响肌动蛋白带强度，此结果与Hsieh等[35]研究向鲭鱼中添加TG可促使肌球蛋白重链聚合，而对肌动蛋白带几乎没有影响情况相似。肌球蛋白和肌动蛋白二者以肌动球蛋白复合体形式存在于鱼糜凝胶中，Choe等[36]指出两者质量比为15∶1，且系统中15%～20%的总蛋白以肌动球蛋白复合体存在，而其余的肌球蛋白为游离状态时，此时凝胶形成能力最大。肌球蛋白轻链带在添加不同量TG后发生不同程度的降解，推测TG促使肌动球蛋白复合体的形成，从而影响凝胶内聚结构和肉制品的质地特性。

图9 鱼糜凝胶SDS-PAGEFig.9 SDS-PAGE pattern of proteins in S.chuatsi surimi gels

肌浆蛋白为分子质量100 kDa以下的水溶性蛋白，主要包括糖酵解酶系、肌酸激酶（40 kDa）、肌红蛋白（17.5 kDa）[37]。由图9可以看出，鳜鱼鱼糜肌浆蛋白35～63 kDa电泳条带依次为甘油醛磷酸脱氢酶、肌酸激酶、醛缩酶、丙酮酸激活酶，4 条条带无明显变化。空白组肌红蛋白条带清晰，加入TG后条带相对减弱，推测鱼糜凝胶红度值的变化可能与TG的加入有关。基质蛋白由几种大分子质量蛋白构成，以胶原蛋白和弹性蛋白为主[38]。在基质蛋白条带中出现一条大分子质量蛋白，Visessanguan等[39]推测是胶原蛋白的产物，但加入TG后对基质蛋白作用不明显。

2.8 TG添加量对鳜鱼鱼糜凝胶感官品质的影响

由图10、表2可以看出，不同TG添加量对鳜鱼鱼糜凝胶表观特征影响显著（P＜0.05），随着TG添加量的增加色泽和气味呈先上升后下降的趋势，在0.6 U/g时达到最大值，并且此时感官评价总分最高。组织状态和表观特征在TG添加量为0.4～0.6 U/g时，鱼糜凝胶肉质紧实，表面颗粒感不明显，说明添加TG后凝胶网络结构变得更加致密，从而使肉质变得紧实；空白组的切面光滑基本无颗粒感，表观特征得分最高，可能是因为未添加TG肉质持水性较高，表面存在水分使其呈现出较光滑的感官。结合各指标评分情况综合考虑，添加TG对鱼糜凝胶组织状态有明显作用，可改善肉质紧实程度。

图10 不同TG添加量的鳜鱼鱼糜凝胶Fig.10 Appearance of S.chuatsi surimi gel with different amounts of TG

表2 TG添加量对鳜鱼鱼糜凝胶感官品质的影响Table 2 Effect of TG addition on sensory evaluation of S.chuatsi surimi gel

3 结 论

TG能催化蛋白质以及肽和各种伯胺之间发生酰基转移，产生交联作用，改善鱼糜凝胶的品质。鳜鱼鱼糜中添加TG后，提高了鱼糜凝胶的白度值和质构特性，随着TG添加量的增加回弹性显著增加，这与TG促进蛋白交联形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键有关。傅里叶红外光谱结果显示，添加0.4、0.8、1.0 U/g TG可以使α-螺旋相对含量减少、β-折叠相对含量增加，说明适量的TG有助于蛋白质分子展开，强化蛋白聚集程度。微观结构显示，TG的添加使鱼糜凝胶网络结构更加紧密，孔径变小。蛋白电泳图谱结果显示，随着TG添加量的增加，肌球蛋白重链条带减弱程度越明显，可见TG促进蛋白交联，增强鱼糜凝胶三维网络结构。但过量添加TG，会影响质构和感官评价结果。综合来看，在鳜鱼鱼糜凝胶中添加0.4 U/g和0.6 U/g TG，可有效改善其凝胶品质，为TG应用于鳜鱼凝胶提供理论依据。