孙守栋 陈 烨 朱静轩 杨雪静

肺炎克雷伯菌易定植于肠道、呼吸道等部位，是目前临床院内感染及社区获得性感染的重要病原体之一。近年来，随着诊疗技术增加及广谱抗菌药物的广泛使用，肺炎克雷伯菌引起的无菌体腔感染越来越受到临床重视[1～3]。现国内外有关分离自无菌体液的肺炎克雷伯菌的毒力因子及耐药性综合分析报道较少，本研究对浙江中医药大学附属第一医院收集的SBF-KP菌株的临床分布、药敏状况、黏液表型、荚膜血清型及毒力基因携带情况进行分析，以期为临床诊治无菌体液肺炎克雷伯菌感染提供参考。

材料与方法

1.菌株来源：收集浙江中医药大学附属第一医院2017年8月～2019年12月无菌体液标本(胸腹腔积液、脓液、胆汁、脑脊液、关节腔积液、骨髓等，不包括血液及尿液)分离的肺炎克雷伯菌83株，剔除同一患者重复菌株。无菌体液：在标本采集、标本处理过程中严格无菌操作，分离出的细菌被认为是感染菌的液体标本。

2.仪器与试剂：MALDI-TOF质谱仪(Bruker)、Vitek-2 Compact 全自动微生物分析系统(法国梅里埃公司)、PCR 仪(美国 Bio-Rad 公司)、10×AceTaq PCR Buffer(含Mg+2)及PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司、电泳仪及紫外凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)、细菌核酸提取盒[天根生化科技(北京)有限公司]、PCR扩增引物合成及产物测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

3.菌株鉴定及药敏试验：按照《全国临床检验操作规程》进行无菌体液标本采集与细菌分离培养，阳性菌株采用MALDI-TOF质谱仪及Vitek-2 Compact 系统进行细菌鉴定及药敏试验(质谱仪鉴定率需达到2.0以上)。质控菌株为大肠杆菌ATCC25922，药敏结果采用美国临床和实验室标准化协会(CLIS)推荐标准进行判断。

4.高黏液型鉴定：用接种环挑取血平板待测菌株，挑起的黏液丝长度≥5mm，为黏液丝试验阳性，重复3次以上确定为高黏液菌株。

5.PCR扩增及序列分析：对无菌体液分离的肺炎克雷伯菌常见荚膜型K1、K2、K57、K5、K20、K54基因及uge、wabG、ycf、ureA、fimH、rmpA、rmpA2、aerobactin、iucA、magA、wcaG、ybtA、kfuB、iroB、alls、iutA、entB毒力基因进行PCR扩增及序列分析。反应条件、反应体系、引物合成参照文献[4～7]。PCR扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序，序列与GenBank数据库在线比对。

6.统计学方法：采用WHONET 5.6软件剔除重复株后进行药敏结果统计分析，采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行统计分析，样本率的比较采用χ2检验或Fisher精确检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.标本来源：共收集SBF-KP菌株83株，其中脓液的检出率最高，为47.0%(39/83)；其次为腹腔积液、胆汁、胸腔积液穿刺液、脑脊液、骨髓，分别为21.7%(18/83)、16.9%(14/83)、7.2%(6/83)、6.0%(5/83)和1.2%(1/83)。

2.药敏结果：83株SBF-KP对临床14种抗菌药物均有不同程度耐药，其中对复方新诺明、氨曲南、环丙沙星、头孢他啶、替卡西林/克拉维酸、左旋氧氟沙星耐药率较高，均大于20%；对替加环素、阿米卡星、碳青霉烯类具有较好的药物敏感度，耐药率分别为6.0%(5/83)、7.2%(6/83)、9.6%(8/83，表1)。

表1 无菌体液分离的肺炎克雷伯菌药敏试验结果

3.荚膜型及高黏液型分布：SBF-KP菌株荚膜型以K1、K2型为主，阳性率分别为39.8%(33/83)、13.3%(11/83)，检测到1株K5荚膜型SBF-KP菌株。SBF-KP高黏液型阳性率为57.9%(48/83)，高黏液型菌株K1、K2荚膜型阳性率分别为45.8%(22/48)、18.8%(9/48)。

4.毒力基因检测：17种毒力基因中entB、fimH、uge、wabG、ureA、ycf基因检出率最高，均大于98.0%；其余毒力基因均有检出，其中iroB检出率最低，为9.6%(8/83，表2，图1)。

图1 rmpA2基因电泳图

表2 无菌体液分离肺炎克雷伯菌毒力因子分布

5.无菌体液中脓液与其他无菌体液毒力因子差异：48株高黏液型菌株中，脓液、其他无菌体液分离的菌株分别为34、14株；脓液标本与其他无菌体液在高黏液表型、rmpA、aerobactin、kfuB检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

高黏液表型是高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)最主要的毒力特征之一，黏液表型调解因子A(rmpA、rmpA2)对维持菌株高黏液型具有重要意义；rmpA、rmpA2位于180～220kb的质粒上，可协同铁载体等其他毒力因子调控菌株毒力表达。本研究SBF-KP菌株rmpA、rmpA2基因阳性率较既往HvKP研究低，且菌株高黏液表型与rmpA、rmpA2基因阳性率不一致，部分携带黏液表型调解因子A菌株并不表达高黏液表型，考虑可能与气杆菌素(aerobactin)、wcaG、rfbP等毒力因子基因缺失有关[10,11]。另外本研究发现，无菌体液中脓液标本的高黏液表型阳性率高于其他无菌体液，差异有统计学意义(P<0.05)，猜测可能与rmpA基因调控有关。荚膜多糖过度分泌可使肺炎克雷伯菌呈高黏液表型，根据荚膜多糖可将肺炎克雷伯菌分为82种荚清型，其中K1、K2型毒力较强且与HvKP密切相关[12,13]。magA位于染色体上，与肺炎克雷伯菌K1荚膜型合成相关，alls基因主要编码尿囊素调节因子激活剂，并且与气杆菌素的生成密切相关，wcaG基因主要编码菌株荚膜中的岩藻糖成分，有助于逃避吞噬细胞的吞噬作用。本研究发现SBF-KP菌株荚膜型以K1/K2高毒型为主，比例大于50%，且alls、magA基因仅存在于K1型肺炎克雷伯菌中，与相关报道一致[14,15]。席健峰等[16]研究发现wcaG基因仅存在K1型肺炎克雷伯菌中，本研究中wcaG在K1、K2型以及未分型菌株均有检出，与其结果不符。

肺炎克雷伯菌铁摄取相关毒力因子(aerobactin、iutA、iucA、ybtA、entB、iroB、kfuB、ycf)对维持菌株定植、侵袭、高毒性具有重要作用，其中气杆菌素aerobactin因子是其最主要的毒力因子[17]。Yu等[6]研究发现K1、K2 荚膜型肺炎克雷伯菌aerobactin的检出率为 100%，本研究K1、K2 荚膜型肺炎克雷伯菌均携带aerobactin基因，与其报道一致。iucABCD是气杆菌素的基因编码簇，本研究iucA与rmpA基因阳性率稍有差别，与iucABCD、rmpA基因位于同一质粒报道不符[18]。kfuB是肺炎克雷伯菌铁离子转运受体，与菌株高毒力密切相关，本研究发现K1型肺炎克雷伯菌均携带kfuB基因，与kfu基因在K1型菌株检出率较高一致[19]。rmpA、iucABCD-iutA基因对菌株高毒力、高致死力具有重要作用，本研究发现高黏液K1/K2型菌株感染均携带rmpA、iucA、iutA毒力基因，且患者预后不佳，提示rmpA、iucA、iutA基因可能与K1/K2型菌株的高毒性、高致死性密切相关[6，20]。本研究SBF-KP菌株entB、fimH、uge、wabG、ureA、ycf基因检出率大于98.0%，且无菌体液脓液标本分离的肺炎克雷伯菌aerobactin、kfuB基因阳性率高于其他无菌体液，差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，SBF-KP菌株对临床常用抗菌药物具有不同程度耐药，对阿米卡星、替加环素、碳青霉烯类药物仍有较好的药物敏感度；另外SBF-KP菌株携带多种毒力因子，且荚膜血清型以K1型、K2型为主，提示临床应进一步加强耐药监测，结合菌株药敏合理选用抗生素，以提高疗效及减少高毒力和高耐药菌株的传播和流行。