吴 梅 侯小娟 再努拉·艾未肉拉 郭小平 唐 亮

鼻咽癌(nasopharygeal carcinoma，NPC)是头颈部常见的恶性肿瘤。NPC在美国和欧洲发生率较低，在东南亚及中国华南地区高发[1]。NPC的致病因素除环境因素外，还包括遗传因素和病毒感染等生物因素[2]。有症状的NPC患者，就诊时多数已是进展期，即使行根治性的放化疗，由于肿瘤对放射线抵抗或耐药导致的局部复发及远处转移风险，仍是临床面临的棘手问题，也是影响患者生存的主要因素[3]。如何有效区分出高危复发及转移患者，运用相应的分子靶向药物是NPC个体化精准治疗的新策略[4]。针对鼻咽癌的早期诊断及预后预测的分子标志物研究已经开展，但临床运用效果还有待验证[5]。

人多梳蛋白2(human polycomd 2, HPC2)基因又名染色盒同源物4(chromobox homolog 4, CBX4)，是多梳蛋白家族(polycomb group, PcG)的重要成员之一，常与其他PcG分子形成转录抑制复合物，发挥其多种生物学功能[6]。同时，HPC2还是一种小泛素分子修饰物(small ubiquitin modifier, SUMO)，对作用底物具有类泛素化调节功能[7]。据相关文献报道，HPC2/CBX4与多种肿瘤的发生、发展密切相关，但是在鼻咽癌中的表达及临床预后作用尚未见报道[8]。本研究从临床样本着手，运用蛋白印迹及免疫组化法，检测HPC2在鼻咽癌组织中的表达情况，联合检测Ki67，结合临床病理及随访资料判断其临床预后价值。

资料与方法

1.一般资料：收集内镜活检的8例新鲜鼻咽癌组织标本(男性7例，Ⅱ期1例，Ⅲ期6例；女性1例Ⅲ期)，及同期8例活检排除肿瘤的鼻咽上皮组织，活检组织取材后立即放入液氮中冻存备用。收集新疆自治区人民医院收治的126例鼻咽癌患者，其中男性99例，患者年龄14～88岁，平均年龄49.5岁，女性37例，患者年龄27～73岁，平均年龄51.3岁，均行根治性放射治疗。纳入标准：①有存档的组织蜡块标本，病理学确诊为鼻咽癌，无其他恶性肿瘤病史；②所有患者入院前均未接受任何特异性抗肿瘤治疗；③患者肿瘤复发和转移经鼻内镜活检，MRI或CT影像检查证实；④患者因鼻咽癌导致死亡。查阅整理病历资料，登记随访数据。无进展生存定义为从确诊之日起至放疗后随访过程中出现肿瘤局部复发、区域淋巴结或远处转移的时间截止，或至末次随访时间。总生存定义为从确诊之日起至放疗后随访过程中发生死亡时间截止，或至末次随访时间。随访数据通过查阅病历或电话随访登记。本研究的实施取得新疆自治区人民医院医学伦理学委员会审批同意，患者签署组织标本使用知情同意书。组织学分类按照2006年世界卫生组织(WHO)头颈部肿瘤病理学和遗传学分类标准，TNM分期采用第8版AJCC/UICC鼻咽癌分期系统[9，10]。

2.Wertern blot法：采用RIPA裂解液提内镜下取活检组织总蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒购自南京凯基公司(Cat no.23227)，检测并配平蛋白浓度。样品总蛋白用SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，之后转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭，HPC2兔抗人多克隆抗体(Cat no.A302-355A, 1∶2000, 美国Bethyl公司)和β-Actin鼠单克隆抗体(1∶10000)4℃过夜。洗膜后放入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠二抗室温孵育，再洗膜后ECL(Cat no.P0018F，碧云天公司)化学发光液显影，凝胶电泳成像仪采集图像保存。Image lab软件分析蛋白条带，将HPC2蛋白印迹条带的灰度与对应的β-actin的灰度值比较，用该比值表示HPC2蛋白的表达水平。

3.免疫组化染色法：将调取的存档鼻咽癌组织蜡块切片并HE染色后，由病理专科医生复诊审核。审核无误后，进一步做免疫组化染色，按照SP两步法标准步骤进行，采用柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)恒压抗原修复，非免疫性山羊血清(中衫金桥)封闭。分别滴加兔抗人特异性HPC2多克隆抗体(货号：IHC-00668, 美国Bethyl公司，稀释1∶100)，兔抗人特异性Ki67多克隆抗体(货号：BS90769，美国Bioworld公司，稀释1∶200)，PBS作为空白对照，用山羊血清做阴性对照，用已知染色强阳性的人乳腺癌组织切片作为阳性对照。

4.免疫组化结果及评分标准：HPC2采用免疫染色半定量法评分，依据阳性染色细胞的信号强度和阳性细胞所占细胞百分比分别评分[9]。染色强度评分标准：细胞核未出现阳性显色为0分；细胞核中出现高于背景的淡黄色为1分；棕黄色为2分；黄褐色为3分。每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，算出阳性细胞平均百分比并计分：无阳性染色细胞为0分；10%～25%为1分；25%～50%为2分；50%～75%为3分；>75%为4分。由两位病理医师采用盲法单独阅片评分，评分结果不一致的，共同商议后决定最终评分。将上述两个分值的乘积定为最终分值，所得评分的中位数为6，因此确定≤6分为低表达组，>6分为高表达组。Ki67评分采用肿瘤细胞核阳性染色百分比评分[10]：≤60%分为低表达组，>60%为高表达组。

结 果

1.HPC2蛋白在新鲜组织中表达：将8对新鲜NPC组织和同期体检的非肿瘤鼻咽上皮组织采用Western blot法检测，NPC组织中HPC2表达为1.830±0.125，鼻咽上皮组织为0.320±0.065,HPC2在NPC组织中表达明显高于鼻咽上皮组织，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 HPC2在鼻咽癌与鼻咽上皮组织中的表达

2.免疫组化法检测HPC2 及Ki67在鼻咽癌组织中的表达状态：鼻咽癌组织中HPC2及Ki67蛋白表达的阳性染色，主要定位于肿瘤细胞的胞核，表现为细胞核中存在黄色至褐色的反应颗粒(图2)。HPC2在鼻咽癌组织中高表达为55.6%(70/126)；低表达为44.4%(56/126)；Ki67在鼻咽癌组织中高表达为61.9%(78/126)；低表达为38.1%(48/126)。

图2 免疫组化检测 HPC2和Ki67在鼻咽癌组织中的表达(SP，×400)

3.鼻咽癌组织中HPC2和Ki67表达相关性：每例患者同时检测HPC2和Ki67两个指标，根据HPC2和Ki67表达情况，将结果分为低表达组和高表达组。HPC2和Ki67表达相关分析发现，两指标的表达之间呈正相关(r=0.354，P<0.01，图3)。

图3 免疫组化检测鼻咽癌组织中HPC2和Ki67表达的相关性

4.HPC2免疫表达与临床病理因素的关系：本组NPC患者的年龄范围为10～80岁，中位年龄约48岁。截至末次随访，所有患者均获得完整随访数据，中位随访时间46个月(2～97个月)，复发46例(46/126，36.5%)，远处转移13例(13/126，10.3%)，死亡49例(49/126，38.9%)，均为鼻咽癌导致死亡。与HPC2的表达相关的因素有T分期(P=0.012)、N分期(P=0.001)、M分期(P=0.026)、TNM分期(P=0.036)、复发状态(P=0.000)及Ki67的表达(P=0.000)。不同性别、年龄、族别、吸烟史、病理分型与HPC2的表达无明显关系(表1)。

表1 HPC2表达与鼻咽癌临床病理因素的关系

5.HPC2联合Ki67表达评估鼻咽癌预后：为进一步验证HPC2和Ki67联合检测对鼻咽癌预后风险预测作用，将NPC患者分成3组，即HPC2和Ki67均高表达为第1组；HPC2高表达Ki67低表达组或HPC2低表达Ki67高表达为第2组；HPC2和Ki67均低表达为第3组。3个组的5年无进展生存率分别为18.2%、55.8%和86.7%，无进展生存率比较差异有统计学意义(Log-RankMantel-COX=38.24，P=0.000，图4A)。3个组的5年总生存率分别为23.1%、62.2%和95.2%，总生存率比较差异有统计学意义(Log-RankMantel-COX=41.43，P=0.000，图4B)。

图4 Kaplan-Meier法分析鼻咽癌组织中HPC2与Ki67表达状态对患者生存的预后作用

讨 论

NPC的复发和转移是多个基因参与的多步骤过程，如何准确预测，选择合适的干预措施和时机是患者临床获益的关键。发掘NPC发生、发展过程中主要驱动基因，筛选有效的分子治疗靶点是目前研究的焦点问题[11,12]。据相关报道，EBV-DNA是有效的诊断、监测指标，但对于EBV阴性的NPC来说，仍需要有效的替代标志物[13,14]。近年来HPC2/CBX4在肿瘤领域的研究逐渐增多，它既是组成PcG蛋白核心分子，也是一种重要的泛素修饰SUMO E3连接酶。在人类肿瘤中发现HPC2/CBX4具有促癌和抑癌的双重功能，在肿瘤生物学功能的调控中，其可以和SUMO化底物相互作用也可以通过直接作用于某些转录因子的启动子区域，进而影响其转录及功能。

目前，大多数研究结果显示HPC2/CBX4是一种参与了肿瘤增殖和血管生成的基因，据报道CBX4在肝细胞癌较癌旁组织表达上调，促进细胞周期进展及肿瘤增殖；在乳腺癌中通过Notch1通路促进肿瘤的生长。本研究发现，HPC2/CBX4在鼻咽癌组织的表达较鼻咽非肿瘤组织的表达上调，可能与鼻咽癌的发生、发展有关。异常丰富的血供是恶性肿瘤的重要特征，据相关文献报道，CBX4 能通过SUMO化修饰调控HIF-1α活性，促进肝细胞癌血管增生。然而CBX4在肿瘤转移方面的功能不尽一致。最近有报道显示，CBX4参与了骨肉瘤的转移，CK1α/CBC4是抑制转移的有效靶点[15]。在肾透明细胞癌中，CBX4与HDAC1相互作用结合于KLF6基因启动子抑制转录，促进肿瘤生长转移，CBX4调节BMI1介导肺癌转移[16，17]。与之相反，在结直肠癌中发现，CBX4却可以通过募集HDAC3抑制RUNX2转录，从而抑制结直肠癌的转移。

本研究发现，HPC2的表达与鼻咽癌的T、N、M分期及Ki67表达有关，生存分析发现HPC2与 Ki67的表达状态与肿瘤无进展生存及总生存关系密切，提示HPC2可能参与了NPC的疾病进展。为初步探讨HPC2是否与NPC肿瘤细胞增殖有关，免疫组化联合检测了Ki67的表达。Ki67蛋白是MKI67基因编码的蛋白，在增殖细胞核表达，是一种肿瘤增殖指标，反映细胞有丝分裂能力。不同肿瘤中Ki67的预后作用有所不同，有报道称Ki67与放射线抵抗有关，是局部进展期NPC的不良预后因素[18]。然而，在大样本量的结肠癌研究发现，Ki67的高表达是良好预后的独立预测因素。在前列腺癌发现Ki67免疫组化染色测量的肿瘤生长分数是小体积或低级别前列腺术前活检的独立预后因素。Ki67表达定量以阳性细胞所占比例评定，通常在肿瘤良恶性鉴别和判断肿瘤增殖使用。本研究中Ki67高表达占61.9%，表明NPC 的恶性增殖能力强。相关分析显示，HPC2与Ki67的表达有相关性，且呈正相关，提示HPC2可能与NPC的肿瘤增殖有关。当HPC2与Ki67在NPC组织中均呈高表达时，患者风险最高，无进展生存和总生存率最低；当HPC2与Ki67均呈低表达时，患者风险最低，无进展生存和总生存率最高；当两者表达不一致时，患者无进展生存和总生存率介于两者之间，属中度风险。因此，联合检测HPC2与Ki67的表达，能有效将不同风险的NPC患者区分开来，供临床治疗做决策，尤其对预后最差的和中度风险的患者及时监测，尽早干预，改善生活质量，提高生存率。本研究的局限性在于样本量还不够大，而且NPC早期的病例数偏少。因此，HPC2在早期NPC的应用还可以加大早期病例样本数进行深入分析。

综上所述，HPC2表达与NPC肿瘤的大小、侵犯范围、淋巴结转移状态和是否合并远处转移的分期因素密切相关，其高表达提示肿瘤进展及NPC预后不良，与Ki67联合检测利于准确判断预后风险及临床个体化干预。