单卫民 管波

膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BLCA)的发病率在泌尿系统肿瘤中较高，在欧洲，BLCA发病率居男性恶性肿瘤的第4位，在女性恶性肿瘤中排在第10位以后[1]。在我国，男性BLCA发病率位居全身恶性肿瘤的第7位，女性排在第10位以后[2]。中国相对于其他国家而言，BLCA发病水平中等。但近10年间，不论是男性还是女性、城市或农村，BLCA发病率均呈逐年增长趋势[3]。

免疫系统的变化在肿瘤发生和发展中起重要作用[4]。近年来，免疫疗法在膀胱肿瘤中已经开展，并显示出良好的治疗效果。使用免疫检查点抑制剂的免疫调节治疗，尤其是使用针对程序性细胞死亡配体1(PD-1)和程序性细胞死亡分子配体1(PDL-1)技术的免疫疗法已被用于治疗多种肿瘤[5]。膀胱内灌注免疫治疗可以诱导机体局部免疫反应，以达到预防膀胱肿瘤复发、控制肿瘤进展的目的[6]。在KEYNOTE-052临床研究中，Pembrolizumab用于一线治疗顺铂化疗无法耐受的局部晚期、不可切除或转移性尿路上皮癌的患者，效果显著，结果显示，中位随访时间5个月，客观缓解率为24%，5%的患者达到完全缓解，19%的患者达到部分缓解，6个月总生存率为67%[7]。

BLCA的发生具有多中心性和高复发率，患者需要定期复查和长期监测。预后情况的判断是临床医师选择治疗方案的重要参考依据，本研究通过挖掘癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库中BLCA免疫相关基因(immune related genes， IRGS)数据，构建BLCA免疫预后分子标签，用以判断BLCA患者的预后，可给予患者更早期的干预。

对象与方法

一、研究对象

从TCGA(https://www.cancer.gov)下载BLCA 414例肿瘤组织以及19例正常膀胱组织的RNA-Seq数据(部分患者有多个癌组织标本)和412例患者的临床数据，包括性别、年龄、种族、病理分期、吸烟状况、放疗、化疗情况及存活状态等。

二、研究方法

1.BLCA肿瘤组织与正常膀胱组织差异分析：在Immport数据库(https://www.immport.org)中下载IRGS资料，并利用R语言的limma包分析BLCA肿瘤组织与正常膀胱组织全部差异基因及免疫相关差异基因，并绘制热图及火山图。

2.BLCA IRGS预后标志物的筛选：采用Lasso-Cox回归进行BLCA免疫预后相关基因筛选，并通过Lasso-Cox的系数构建分子标签。评分风险(Risk score)=βgene1×EXPgene1+βgene2×EXPgene2+……+βgene5×EXPgene5(EXP：基因的表达水平；β：回归相关系数)。代入相关数据后，计算分子标签得分。分别通过分子标签得分的中位数将BLCA患者划分为高表达组和低表达组。

结 果

一、纳入对象的基本情况

病例总数为412例，其中男304例(73.79%)，女108例(26.21%)；死亡182例(44.17%)，存活230例(55.83%)；患者基本情况见表1。

表1 TCGA数据库中BLCA患者基本特征[例(%)]

续表1 TCGA数据库中BLCA患者基本特征[例(%)]

二、 BLCA组织和正常膀胱组织全部差异表达基因及差异IRGS

从TCGA下载412例BLCA患者的RNA-Seq测序数据，其中正常样本数据19例，肿瘤样本414例，差异分析得到BLCA癌组织和正常膀胱组织中差异表达的基因7 157种，其中差异IRGS 303种。对筛选出的差异表达的基因及差异IRGS进行聚类分析，并绘制热图和火山图，见图1。

图1 BLCA患者癌和癌旁组织差异表达基因的热图(A)、差异IRGS热图(B)及火山图(C、D)

三、BLCA IRGS预后标志物的筛选及构建分子标签

将筛选出的303种差异IRGS表达数据结合生存数据进行单因素Cox分析，得到69种与BLCA预后相关的IRGS(P<0.05)。

将412例肿瘤组织样本BLCA IRGS表达数据按30%和70%随机分为两组，70%组为训练组，用于筛选预后分子标签；30%组为测试组，用于测试筛选出的分子标签预测预后效果。

将单因素回归分析筛选出的69种与BLCA预后相关的IRGS进一步做Lasso回归分析(图2)和多因素Cox分析，最终筛选出5种与BLCA预后相关的IRGS，见图3，分别为ADCYAP1R1、APOBEC3H、OAS1、PTGER3、SH3BP2，5种基因单因素及多因素预后分析结果见表2。利用5种IRGS联合回归系数构建分子标签，Risk score=βgene1×EXPgene1+βgene2×EXPgene2+……+βgene5×EXPgene5(EXP：基因的表达水平；β：回归相关系数)。代入相关数据后，计算分子标签值。

A：ADCYAP1R1生存曲线；B：APOBEC3H生存曲线；C：OAS1生存曲线；D：PTGER3生存曲线；E：SH3BP2生存曲线图3 分子标签中5种IRGS生存曲线

A：不同IRGS系数变化情况；B：二项式偏差曲线图图2 Lasso 回归筛选BLCA IRGS预后相关分子

表2 筛选出的5种BLCA预后相关IRGS单变量及多变量分析结果

分子标签表达式为：Risk score=0.101 31×EXPADCYAP1R1-0.137 76×EXPAPOBEC3H-0.158 94×EXPOAS1+0.091 75×EXPPTGER3-0.186 48×EXPSH3BP2。

代入相关数据后，计算分子标签分值。通过分子标签得分的中位数将患者划分为高分组和低分组，结合TCGA中患者生存时间及生存状态在训练组和测试组分别绘制生存曲线，并比较高分组和低分组生存曲线差异有无统计学意义，见图4A、B、C，如图所示分子标签值在训练组、测试组、全部数据组与BLCA患者生存期显著相关，分子标签值越高患者预后越差；并以1年、3年、5年生存期绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线，见图4D、E、F，其中全部数据组1年、3年、5年ROC曲线下面积分别为0.663、0.694、0.704。

A：训练组生存曲线；B：测试组生存曲线；C：全部数据生存曲线；D：训练组1年、3年、5年ROC曲线；E：测试组1年、3年、5年ROC曲线；F：全部数据1年、3年、5年ROC曲线图4 分子标签生存曲线及ROC曲线

讨 论

BLCA是一种多基因相关肿瘤，在机体内在因素与外在因素的联合作用下导致了BLCA的发生，是由细胞中基因的改变并积累而逐步形成的，细胞的癌变是一个十分复杂的过程[8]。目前，膀胱镜和尿脱落细胞检查仍是诊断BLCA的金标准[9]，由于BLCA仍缺乏较为准确的预后标志物，分子生物学标志物是目前BLCA诊治研究中的前沿与热点。

TCGA是美国政府发起的癌症和肿瘤基因图谱计划，试图通过应用基因组分析技术，特别是采用大规模的基因组测序，将人类全部癌症的基因组变异图谱绘制出来，并进行系统分析，旨在找到所有致癌和抑癌基因的微小变异，了解癌细胞发生、发展的机制，在此基础上取得新的诊断和治疗方法，最后可以勾画出整个新型“预防癌症的策略”。而TCGA数据库中不仅有高通量测序结果，而且有BLCA临床预后数据。

由于肿瘤组织免疫细胞、血管生成以及其他过程与正常组织不同，肿瘤或其他细胞(如免疫细胞)释放的蛋白质或其他分子已被作为潜在的生物标志物研究，特别是在多种标志物联合分析时，能产生较好的预测能力。本研究通过提取TCGA数据库中BLCA患者的临床数据以及BLCA IRGS表达数据，采用Lasso-Cox回归分析从中筛选出5种与BLCA预后相关的IRGS，分别为ADCYAP1R1、APOBEC3H、OAS1、PTGER3、SH3BP2。联合这5种IRGS构建了BLCA预后分子标签，通过该分子标签判断BLCA预后效果显著。筛选出的这5种IRGS已有相关研究发现与肿瘤高度相关，APOBEC3H介导的去甲基化在头颈部鳞状细胞癌免疫反应中起到关键作用[10]；OAS1与乳腺癌预后相关[11]；PTGER3与卵巢肿瘤发生及卵巢肿瘤对顺铂治疗的耐药性相关[12]；SH3BP2与胃肠道间质肿瘤生长有关[13]。该5种基因是否在BLCA的发生、发展中起到作用目前未见相关研究，有待进一步深入研究。

综上所述，本研究通过对TCGA数据库的挖掘，筛选并构建了新的BLCA免疫相关预后分子标签，将其整合成组合标志物后有望用于临床BLCA预后预测，为BLCA病因、发病机制、治疗、预后判断提供新的研究思路和方向。