朱海静，许英，周娟，杨洁，李娜，徐冬云，朱斌

(1.火箭军特色医学中心药剂科，北京 100088； 2.陆军第七十一集团军医院 a.药剂科，b.肿瘤科，江苏 徐州 221004)

食管癌是一种常见恶性肿瘤，发病率和病死率均较高[1]。由于缺乏早期诊断的临床生物标志物，食管癌确诊时多为晚期，患者生存率低[2]。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是食管癌的主要类型之一，与营养、不良饮食习惯等因素相关，已成为威胁我国人民健康的主要疾病之一[3]。高流通量、高分辨率技术主要对全球范围内变化的代谢组进行定性或定量分析，并将其应用于各研究领域[4]。代谢组学旨在捕获不同生物样品中低分子量代谢物的生物信息，以提供生物体的详细信息和当前状态，已成为筛选有价值生物标志物或评价药物毒性、药效的有力工具[5-7]。质谱和核磁共振质谱是最常用的代谢分析仪，其中液相色谱-质谱具有良好的分离复杂生物样品的能力，且灵敏度高[8-11]。超高效液相色谱综合高分辨率轨道分析质谱(ultra-high performance liquid chromatography coupled with high resolution orbitrap mass spectrometry，UPLC-Orbitrap-MS)的代谢组学是寻找ESCC潜在生物标志物的可靠且有用的方法，是未来对生物标志物进行深入研究的基础。本研究旨在筛选基于代谢组学的ESCC生物标志物，以期为ESCC的早期诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2019年5月陆军第七十一集团军医院肿瘤科收治的12例ESCC患者的临床病理标本作为研究对象，其中男10例、女2例，年龄56～78岁，平均(66.4±6.1)岁；病理分级：中等分化10例，低分化2例；临床分期：Ⅱ期9例，Ⅲ期3例；患者均无吸烟、饮酒史。依据美国食管癌联合委员会[12]确认所有组织标本的临床病理分期，12例患者的临床病理分期及基本情况见表1。本研究经解放军陆军第七十一集团军医院伦理委员会批准，所有患者均签署了知情同意书。

1.2方法

1.2.1试剂与仪器 试剂包括HPLC级甲醇、乙腈、氯仿和甲酸(德国默克公司)，组织裂解液Ⅱ(德国Dusseldorf公司)，去离子水由纯水仪(美国Millipore公司，型号Milli-Q50SP)制备。静电场轨道阱质谱(美国Thermo Fisher Scientific公司)，UPLC 3000系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2.2样品收集和制备 经食管切除术获得肿瘤及癌周组织，并经组织病理学确诊ESCC。手术切除的肿瘤和癌周组织经液氮冷冻后，在-80 ℃固态二氧化碳条件下保存转运至南京医科大学。在代谢组学分析前，室温下解冻所有样品，将每个样品组织各20 mg转移到2 mL离心管中，向其中加入去离子水-乙腈-氯仿(2∶5∶2，v/v/v)萃取液1 mL，旋涡混合，随后将组织裂解液Ⅱ在50 Hz频率下混合15 min后，以离心加速度10 000×g离心10 min，取600 μL上清液用于分析。

表1 ESCC患者基本信息

1.2.3UPLC-Orbitrap-MS分析 代谢谱在配备有加热电喷雾源的静电场轨道阱质谱(美国Thermo Fisher Scientific公司)上进行。分辨率设为7 000，采用全扫描模式(70～1 050 amu)，同时以正负模式采集。

代谢产物用UPLC 3000系统[美国Thermo Fisher Scientific公司，色谱柱为1.9 μm Hypersile GoldC18柱(100.0 mm×2.1 mm)]分离，样品量5 μL。采用0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈(B)组成的多步梯度洗脱，15 min内将溶剂B从5%线性增加到95%，流速为0.4 mL/min。95%溶剂B洗涤洗脱柱2 min，在5%溶剂B中重新平衡。UPLC和OrbitRAP质谱仪系统均使用Xcalibur 2.2软件(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行数据分析。

1.3数据分析 对UPLC-Orbit RAP MS系统中的原始数据进行预处理。使用SIEVE软件(美国Thermo Fisher Scientific公司)分析原始数据，包括同位素质量、保留时间、峰强度和可能的元素组成。生成的数据集导入SIMCA-P 13.0软件(瑞典Umetrics公司)进行多变量统计分析和模式识别。利用主成分分析(principal component analysis，PCA)法将高维光谱简化为包含大部分生物信息的2个或3个主成分，实现分类趋势的可视化。运用偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)得到变量重要性，反映每个变量对分类的相对贡献，从而寻找肿瘤与相应正常组织之间的可鉴别变量[13-14]。

2 结 果

2.1代谢组学分析 对UPLC-Orbitrap-MS获得的原始数据进行预处理，从肿瘤及相应正常组织中获得5 172个特征(3 795为正离子模式，1 377为负离子模式)，对质量控制样本进行PCA分析，根据样本第一主成分得分绘制质量控制图(图1)，每个样本的聚集结果(<2s)均可接受，分析过程的总体情况良好。对结果进行PCA和PLS-DA分析(图2)，结果显示组间明显分离，表明肿瘤与正常组织代谢模式的差异显著。得分图显示，在更复杂的多变量模型中，PLS-DA模型的分类和分离效果较PCA更佳。采用R2Y反映拟合优度，Q2反映模型的可预测性，本研究PLS-DA模型的拟合度和预测值分别为0.990、0.763，两者均>0.5。

2.2寻找判别变量 将多元统计分析的变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值与单因素统计分析的P值相结合，应用于显著性差异变量的选择。将VIP>1.0且P<0.05的变量作为候选判别变量，确定潜在生物标志物。

2 s为控制线，3 s为警戒线

2.3代谢物鉴定 以判别变量质荷比(m/z)和保留时间(tR)的形式进行定性分析，并确定为潜在的生物标志物。在代谢组学研究前建立一个内部代谢物库，以便于后续鉴别代谢组学。本研究所建立的文库包含493个真实的化学标准，在相同色谱和质谱条件下分析，所获得数据与文库中化学标准具有可比性。对已获得的数据进行分析，候选生物标志物见表2，代谢物的保留时间变化见表3。应用代谢谱热图像显示相应正常组织和肿瘤组织之间各候选生物标志物的总体趋势，见图3。

2a：主成分分析得分图；2b：偏最小二乘判别分析得分图

表2 鉴别ESCC和正常黏膜的代谢产物统计学数据分析结果

表3 已鉴定代谢物的保留时间偏移

续表3

2.4潜在的诊断性生物标志物的表征 采用受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve，ROC曲线)对潜在生物标志物的鉴别能力进行深入

Corresponding normal tissue：相应的正常组织；Tumor tissue：肿瘤组织；Low：低；High：高；Proline：脯氨酸；LysoPC：溶血磷脂胆碱；Creatinine：肌氨酸酐；L-Glutamine：L-谷氨酰胺；Methionine：甲硫氨酸；Choline：胆碱；Citicoline：胞磷胆碱；Decanoylcarnitine：癸酰肉碱；Phenylalanine：苯丙氨酸；β-hydroxybutyrate：β-羟丁酸；Octanoylcarnitine：辛烷酰肉碱；Valine：缬氨酸；Nonanoylcarnitine：壬酰肉碱； Uric acid：尿酸；Undecanoylcarnitine：十一烷基肉碱；Lactulose：乳果糖；Asparagine：天冬酰胺酸；Carnitine：肉毒碱；Oxoglutaric acid：酮戊二酸；Cholic acid：胆酸；Citric acid：柠檬酸；Linoleic acid：亚油酸；LysoPE：溶血磷脂酰乙醇胺；红色：高水平代谢物；绿色：低水平代谢物

评价分析，根据曲线下面积(area under curve，AUC)将代谢产物排序，制作热图并证明每种潜在生物标志物的辨别能力，将AUC>0.85的代谢物作为简化组，进一步评价其辨别力，该代谢组学小组的AUC值为0.937，表明鉴别能力优于任何单一代谢物，见图4。

3 讨 论

代谢组学在肿瘤诊断及其机制研究中具有重要意义，有助于更好地理解ESCC的代谢组学。研究显示，与癌周组织相比，肿瘤组织中的溶血素水平异常，通过溶血磷脂酶A1，溶血卵磷脂能被代谢为不同种类的脂肪酸，并通过线粒体中的β氧化水解产生必要的能量[15]。此外，溶血磷脂酶D还可以转化为溶血磷脂酸，在促进细胞增殖中起重要作用，研究表明，肿瘤的发生与正常细胞的异常增殖密切相关[16-17]。本研究对12例ESCC患者的活检标本和相应的正常组织进行非靶向代谢组学研究，并进行模式识别分析对两组间的代谢谱进行分类，这些潜在的生物标志物主要包括氨基酸代谢、磷脂生物合成、能量代谢和脂肪酸代谢等，根据溶血磷脂水平下调及其分解代谢作用，推测溶血磷脂酶D过表达引起的溶血磷脂减少，导致溶血磷脂酸增加，进而参与肿瘤的发生。

ROC：受试者工作特征曲线；AUC:曲线下面积；LysoPC：溶血磷脂胆碱；Carnitine：肉毒碱；Citicoline：胞磷胆碱；L-Glutamine：L-谷氨酰胺；Choline：胆碱；Lactulose：乳果糖；Citric acid：柠檬酸；β-hydroxybutyrate：β-羟丁酸；Phenylalanine：苯丙氨酸；Linoleic acid：亚油酸；Methionine:甲硫氨酸；Proline：脯氨酸；Creatinine：肌氨酸酐；Valine：缬氨酸；Cholic acid：胆酸；Decanoylcarnitine：癸酰肉碱；Oxoglutaric acid：酮戊二酸；LysoPE:溶血磷脂酰乙醇胺；Asparagine：天冬酰胺酸；Uric acid：尿酸；Undecanoylcarnitine：十一烷基肉碱；Octanoylcarnitine：辛烷酰肉碱；Nonanoylcarnitine：壬酰肉碱

与癌周组织相比，肿瘤组织中肉碱水平升高，而肿瘤细胞中的肉碱(去氧基肉碱、辛基肉碱、壬基肉碱、十一烷基肉碱)水平降低。据报道，肉碱及其分解代谢物(包括酰基肉碱)参与能量代谢，影响细胞能量的分布，并在线粒体脂肪酸转运中起重要作用[18]。在此过程中，通过酰基辅酶A的酯化将肉碱分解为酰基肉碱，因此，酰基辅酶A脱氢酶的缺乏或活性降低可引起酰基肉碱下调和肉碱上调[19]。另有实验研究显示，通过肉碱的代谢紊乱可以进一步研究酰基-辅酶A脱氢酶的活性[20]。

加速细胞增殖可导致膜磷脂代谢紊乱[21]。本研究中，胆碱水平降低，且主要分解代谢产物甲硫氨酸水平也显著降低。甲硫氨酸作为跨甲基化反应的中间体，是体内的主要甲基供体，能够为肌酸提供甲基，参与胆碱的代谢[22-23]。胆碱及其主要代谢产物的水平可反映肿瘤组织中的异常磷脂代谢，故推测其具有诊断ESCC的潜在价值。

谷氨酰胺调节异常与ESCC肿瘤脂质代谢异常有关，在癌细胞增殖中，为满足细胞代谢的需要，脂肪的需求量增加，由于细胞增殖加速，对膜脂生物合成的需求增加，脂肪酸代谢被激活[24]。本研究中，6种氨基酸代谢产物均与食管癌的代谢紊乱相关，且β-羟丁酸水平异常与上述脂肪酸代谢失调及相关缬氨酸显著下调有关。肿瘤细胞增殖速率加快可引起机体能量代谢升高，增加柠檬酸和酮戊二酸分解，从而生成更多ATP[25]，本研究结果与其一致。

总之，本研究利用UPLC-Orbitrap-MS平台进行非靶向代谢组学实验，通过与内部文库进行对比，发现并鉴定出26种代谢产物，并通过UPLC-Orbitrap-MS为基础的代谢组学方法寻找ESCC潜在生物标志物，为ESCC的临床诊断及其发病机制研究提供了相关依据。