陈晨 李永圆 王海霞 于洋 李正

摘要 目的：納米粒子特有的小尺寸效应和表面效应使得纳米银粒子具有广谱抗菌活性。但纳米银粒子浓度过高可能会对其他细胞或器官等造成毒性或损伤，所以为了更好地发挥抗菌活性，对纳米银粒子进行快速、准确的分析是极为必要的。方法：通过对纳米银粒子吸附方法和纸基芯片的优化和筛选，测定纳米银粒子的激光诱导击穿光谱图。通过特征峰位与标准谱图库进行比对对纳米银粒子进行定性分析，通过特征光谱强度与纳米银浓度的线性回归关系建立纳米银粒子分析的定量模型。结果：通过重复3次“浸渍-干燥”工艺，定量滤纸表面吸附的纳米银粒子在328 nm、338 nm、520 nm、546 nm和827 nm处显示出银的特征峰。在312.5～5 000 μg/mL浓度范围内，520 nm波长处纳米银的特征峰强与浓度呈良好线性关系（r=0.998 8）。结论：激光诱导击穿光谱分析技术可用于纳米银定性定量分析，分析方法准确，灵敏度高，且检测过程方便便捷，易于实际推广。

关键词 激光诱导击穿光谱;纳米银;定量分析;定性分析

Development of Qualitative and Quantitative Analysis Method of Silver Nanoparticles Based on Laser Induced Breakdown Spectroscopy

CHEN Chen1，LI Yongyuan1，WANG Haixia1，2，3，YU Yang1，2，3，LI Zheng1，2，3

（1 College of Pharmaceutical Engineering of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China; 2 State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China; 3 Haihe Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）

Abstract Objective：The unique small size effect and surface effect of nanoparticles make silver nanoparticles have broad-spectrum antibacterial activity.However，too high concentration of silver nanoparticles may cause toxicity or damage to other cells or organs.Therefore，in order to better exert antibacterial activity，it is extremely necessary to analyze silver nanoparticles quickly and accurately.Methods：By optimizing and screening the nano-silver particle adsorption method and paper-based chip，the laser-induced breakdown spectra of nano-silver particles were measured.The qualitative analysis of nano-silver particles was carried out by comparing the characteristic peak position with the standard spectral library，and the quantitative model of nano-silver particle analysis was established by the linear regression relationship between the characteristic spectral intensity and the concentration of nano-silver.Results：By repeating the “dipping-drying” process three times，the nano-silver particles adsorbed on the surface of the quantitative filter paper showed characteristic peaks of silver at 328 nm，338 nm，520 nm，546 nm and 827 nm.In the concentration range of 312.5～5 000 μg/mL，the characteristic peak intensity of nano-silver at the wavelength of 520 nm had a good linear relationship with the concentration （r=0.998 8）.Conclusion：The LIBS analysis technology can be used for qualitative and quantitative analysis of nano-silver.The analysis method is accurate and sensitive，and the detection process is convenient and convenient，which can be easily used in practice.

Keywords Laser induced breakdown spectroscopy; Nano-silver particles; Quantitative analysis; Qualitative analysis

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.004

纳米银颗粒具有广谱抗菌活性，对多种革兰阳性、革兰阴性细菌具有抑菌和杀菌作用[1]。据报道，纳米银粒子主要的抑菌机制是基于纳米银表面的阳离子与细菌蛋白中的硫醇基团间的特异性结合能力，在细菌表面黏附积累并穿透细胞膜，导致细胞膜和细胞成分被破坏，从而抑制或阻止细菌生长和细胞分裂，最终导致细菌死亡[2]。这种抑菌活性与纳米银颗粒的大小、形状和浓度紧密相关，如果浓度过高，会对其他细胞或器官等造成毒性或严重损伤[3]。因此，对纳米银粒子建立准确的分析方法对于其更好地发挥抗菌活性是极为必要的。

目前，对银离子和单质银的定性和定量分析方法较为成熟，而对纳米银粒子的分析研究比较少。应用于纳米银分析检测的方法主要有电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[4]、原子吸收光谱法（AAS）[5]、原子发射光谱法（AES）[6]、分光光度法[7]和电化学分析法[8]等。但上述方法均存在一定的缺陷，如ICP-MS方法测试成本高，普及化应用程度低。AAS和AES方法都需要复杂的前处理工艺，耗时较长。分光光度法受干扰因素较多，且对样品浓度有一定限制。而电化学分析法稳定性不高，灵敏度也有待于进一步提高。因此，对纳米银的分析檢测方法不仅要求准确度高，而且要便捷、易用，便于实际推广。

本文采用激光诱导击穿光谱（Laser Induced Breakdown Spectroscopy，LIBS）[9]技术用于纳米银的定性和定量分析研究。LIBS分析技术基于“蓄能-释放”的模式，将高能量在很短的时间内释放出来，并在物体表面激发出瞬态等离子体并向外发射具有特定波长的光，以此来对被测元素进行分析，检测灵敏度很高。每次检测时间仅需一秒左右，方便快速且成本低廉，非常实用。所以这种方法在金属元素的分析检测方面引起了很多研究工作者的关注，但是在金属纳米材料，尤其是纳米溶胶分析应用方面的研究较少。因为这种技术在液体样品分析时容易受到溶剂影响，影响检测效果[10]。因此，如何把液体样品分析转化为固体样品分析，是LIBS技术应用于金属纳米溶胶样品分析的关键。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 激光诱导击穿光谱（海洋光学亚洲公司，型号：LIBS-MX2500+）;电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，美国，型号：AB135-S）;台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：H1650R）;紫外可见分光光度计（Agilent公司，美国，型号：Cary 8454）;动态光散射纳米粒径仪（布鲁克海文仪器公司，美国，型号：NanoBrook Omni 280137）;高分辨率透射电子显微镜（Hitachi公司，日本，型号：HT7700）;傅里叶变换红外光谱仪（Shimadu公司，日本，型号：IRTracer-100）;纯水机（北京颇尔过滤器有限公司，型号：Cascada Ⅰ）。

1.1.2 试剂 硝酸银（天津市北方天医化学试剂厂，批号：7761-88-8），柠檬酸钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：6132-04-3）。醋酸纤维素膜（NC膜，孔径：0.22 μm，北京兰杰柯科技有限公司，批号：21174257）;慢性定性滤纸（=7 cm，灰分≤0.13，杭州特种纸业有限公司，批号：GS/T1914-2007）;慢性定量滤纸（=9 cm，灰分≤0.01，杭州特种纸业有限公司，批号：0428060216）;pH精密试纸（国药集团化学试剂有限公司，批号：F507LD0225）。实验用水为纯水机制备的去离子水。

1.2 方法

1.2.1 纳米银颗粒的制备 将50 mL硝酸银溶液（1 mmol/L）高温加热至沸腾后，缓慢滴加27 mL柠檬酸钠溶液（质量浓度为1%），并继续搅拌直至溶液颜色变为黄绿色。然后将溶液冷却至室温，经多次离心分离去掉上清液得到纳米银溶胶，真空干燥后得到纳米银溶胶颗粒，并于4 ℃冰箱中在氮气氛中密封保存。

1.2.2 纳米银颗粒的表征 使用紫外可见分光光度计对得到的纳米银溶胶进行吸光度测试，运用傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）考察纳米银颗粒的化学结构特征，并运用高分辨率透射电子显微镜（TEM）对纳米银溶胶的形貌进行表征，通过动态光散射纳米粒径仪（DLS）测量纳米银粒子的水合粒径范围。

1.2.3 检测芯片筛选及制备 精密称定纳米银固体颗粒10 mg，加入1 mL去离子水混匀后放入超声机里分散成均匀溶液后取出得到浓度为10 000 μg/mL的供试品溶液。然后用去离子水逐级稀释得到浓度为5 000 μg/mL、2 500 μg/mL、1 250 μg/mL、625 μg/mL和312.5 μg/mL的纳米银溶液。选取NC膜、pH精密试纸、定性滤纸和定量滤纸作为4种纸基芯片用于纳米银颗粒吸附。将这4种纸基芯片分别打孔制成直径为0.8 cm的圆形纸片，将这4种芯片分别浸渍于特定浓度的纳米银溶液中，10 min后取出红外灯烘干，此为“浸渍-干燥”过程，此过程分别重复1次、2次、3次，得到不同吸附次数的检测芯片，考察不同纸基芯片的吸附效果及不同吸附过程的影响。

1.2.4 LIBS光谱校正及采集 在LIBS光谱采集前需要用空白芯片进行校正。通过调整MVCMltDvc摄像头软件，固定激光与载物台的垂直距离。再水平调整载物台坐标，使激光光束垂直且依次照射于检测芯片的三等分面积内，测试3次，记录坐标值。检测芯片依据这3组坐标值进行LIBS光谱采集。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 标准曲线 精密量取5个浓度的纳米银供试品溶液各1 mL，将吸附效果最好的纸基芯片分别浸渍于不同浓度的供试品溶液中，通过“浸渍-干燥”过程后测量纸基芯片中纳米银颗粒的LIBS光谱。以浓度（C，μg/mL）为横坐标，特征波峰处的峰强值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。

1.2.5.2 精密度试验 将一个吸附效果最好的纸基芯片浸渍于625 μg/mL的供试品溶液中，重复3次“浸渍-干燥”过程后，在纸基芯片的不同位点处采集6次LIBS光谱，计算峰强的相对标准偏差（RSD）值。

1.2.5.3 稳定性试验 将一个吸附效果最好的纸基芯片浸渍于312.5 μg/mL的供试品溶液中，重复3次“浸渍-干燥”过程后，分别隔0、1、2、3 h后进行LIBS光谱测试，并考察结果稳定性。

1.2.5.4 重现性试验 平行选取六片吸附效果最好的纸基芯片，分布浸渍于6个同等浓度的纳米银溶胶（312.5 μg/mL）中，重复3次“浸渍-干燥”过程后，进行LIBS光谱测试，并考察结果重现性。

1.2.5.5 加样回收率 在1 mL浓度为1 250 μg/mL纳米银溶液中分别加入1 mL浓度为1 250 μg/mL、625 μg/mL，312.5 μg/mL的溶液，每个浓度重复测定3次并计算浓度实测值，和理论浓度值做对比计算回收率。

2 结果

2.1 纳米银溶液表征 紫外-可见光谱图可以看出纳米银粒子的吸收峰在417 nm处，与文献中记录的特征吸收波长基本一致，說明通过化学反应成功制备纳米银溶液。见图1。纳米银粒子的TEM检测结果可以看出纳米银的平均粒径为60 nm，呈椭球形分布。见图2。

通过DLS对合成的纳米银颗粒的水合粒径进行表征，从图3可以看出合成的纳米银颗粒粒径分布在35～75 nm之间，分布较宽。此外，采用FTIR技术对制备的纳米银颗粒进行结构表征。见图4。纳米银在3 433 cm-1处的显著吸收峰归属于O-H伸缩振动，在1 581 cm-1处的吸收峰对应于C=O伸缩振动，而在1 381 cm-1处的吸收峰代表C-H伸缩振动[11]。

2.2 纸基芯片筛选 为了考察NC膜、pH精密试纸、定性滤纸和定量滤纸4种芯片的吸附性能，将混合紫薯紫染料后的纳米银溶胶滴于4种材质的纸基芯片上，3 min后观察吸附效果。pH试纸片上中心区域颜色较深，边缘处浅，“咖啡环”明显，说明扩散不够均匀。而纳米银颗粒在NC膜上扩散速度很慢，扩散效果也不好。相较于前二者，纳米银颗粒在定性滤纸和定量滤纸上扩散较为均匀，但定性滤纸边缘处可见一圈浅色带，不如定量滤纸分布均匀。见图5。

2.3 纳米银粒子的定性分析 纳米银粒子的LIBS光谱图，其中*标识的为纳米银粒子的特征峰，分别分布于328 nm、338 nm、520 nm、546 nm、827 nm波长处，这5个特征峰位与标准谱图库中银的特征峰位对应，说明此种方法可以用于纳米银粒子的定性分析。见图6。

2.4 浸渍工艺优化 为了获得均匀分布的载有纳米银粒子的检测芯片，我们分别考察了4种纸基芯片对5个浓度梯度纳米银粒子（5 000 μg/mL、2 500 μg/mL、1 250 μg/mL、625 μg/mL和312.5 μg/mL）的吸附情况，每片芯片重复测定4次，理论上在5个特征吸收峰位处会得到100个测试数值。我们分别统计了4种纸基芯片在不同“浸渍-干燥”工艺次数下的测定结果。当“浸渍-干燥”工艺为1次或2次时，均会出现测量结果数目缺失的情况，说明两次“浸渍-干燥”工艺不完全，样品分布不均匀。而当工艺参数调整为3次时，不论哪种纸基芯片都能得到理论测试数值，说明3次“浸渍-干燥”工艺次数是必要且稳定的操作参数。此外，定量滤纸的扩散效果较好，即使经过一次“浸渍-干燥”工艺也能得到全部的测试参数，但是为了得到稳定的测试结果，我们选取三次“浸渍-干燥”工艺作为检测芯片制备的关键工艺参数。见表1。

2.5 纳米银粒子的定量分析

2.5.1 标准曲线考察 在5个浓度梯度的纳米银粒子溶液中，进一步考察4种纸基芯片在5个特征峰位处的线性回归关系。均经过3次“浸渍-干燥”工艺处理后，不同芯片在各个特征波长处的相关系数（r）值。见表2。据此依然可以看出，定量滤纸作为检测芯片时，在各个特征波长处获得的定量关系效果最好。在328 nm、338 nm、520 nm、546 nm和827 nm波长处，定量滤纸芯片上的检测结果与纳米银溶胶浓度分布的线性关系见图7（a～e）。

从图7可以看出，520 nm波长处的线性关系最好。所以选定“浸渍-干燥”工艺重复3次，检测芯片为定量滤纸，520 nm波长处的吸收峰作为纳米银定量测试标准。520 nm处的LIBS峰强值与纳米银浓度关系的线性回归方程为y=8.299 1x-1 658.5，r=0.998 8，线性范围为312.5～5 000 μg/mL。此定量关系线性回归关系好，波长分布范围宽，适宜做纳米银粒子的定量测试。

2.5.2 精密度 对在定量滤纸芯片上的6个不同位点处采集的特征峰值进行分析，6个峰值的RSD值为3.47%，表明该测试方法具有良好的分析精密度。

2.5.3 稳定性试验 对不同时间间隔下待测芯片上的特征峰强进行分析，RSD值为1.6%，说明此测试芯片在3 h内可保持数据稳定性。

2.5.4 重复性试验 对6片定量滤纸在同等浓度的纳米溶胶中获得的特征峰进行分析，6个峰强的RSD值为2.74%，表明该方法重现性良好。

2.5.5 加样回收率 3种加标量对应的样品回收率分别为100.04%、99.62%、100.75%，平均加样回收率为100.13%，RSD值小于2%，表明本方法准确性高。见表3。

3 讨论

为了实现水中纳米银粒子的超灵敏快速检测，本文提出了一种基于激光诱导击穿光谱技术的纳米银定性定量分析方法，本方法采用纸基芯片作为测试载体，通过“浸渍-干燥”工艺将液体银样品转化为固体样品进行测试。通过比较，定量滤纸的测试效果最好。定量滤纸表面吸附的纳米银粒子在328 nm，338 nm，520 nm，546 nm和827 nm处显示出银的特征峰。在520 nm处，纳米银的特征峰强度与浓度呈良好线性关系。本研究表明，通过合理的测试芯片选择及优化样品前处理工艺，可以通过激光诱导击穿光谱技术实现纳米银粒子的定性定量分析，分析結果准确，线性范围宽。且测试时间短，方法便捷度高。未来，这种方法可以推广到其他金属的液体样品测试分析中，为金属样品的快速、准确分析提供新的思路和方法。

参考文献

[1]Spagnoletti FN，Spedalieri C，Kronberg F，et al.Extracellular biosynthesis of bactericidal Ag/AgCl nanoparticles for crop protection using the fungus Macrophomina phaseolina[J].J Environ Manage，2019，231：457-466.

[2]Das CGA，Kumar VG，Dhas TS，et al.Antibacterial activity of silver nanoparticles（biosynthesis）：A short review on recent advances[J].Biocatal Agric Biotechnol，2020，27：101593.

[3]Kathiravan V，Ravi S，Ashokkumar S.Synthesis of silver nanoparticles from Melia dubia leaf extract and their in vitro anticancer activity[J].Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2014，130：116-121.

[4]Hampton JO，Specht AJ，Pay JM，et al.Portable X-ray fluorescence for bone lead measurements of Australian eagles[J].Sci Total Environ，2021，789：147998.

[5]Kasa NA，Sel S，Chormey DS，et al.Determination of cadmium at trace levels in parsley samples by slotted quartz tube-flame atomic absorption spectrometry after preconcentration with cloud point extraction[J].Measurement，2019，147：106841.

[6]Guo C，Lv L，Liu Y，et al.Applied Analytical Methods for Detecting Heavy Metals in Medicinal Plants[J].Crit Rev Anal Chem，2021：1-21.

[7]Cao YL，Liu GQ，Qin XT，et al.Preparation and application of 2-chlorophenol molecularly imprinted photonic crystal hydrogel sensor[J].J Macromol Chem，2021，58（5）：336-343.

[8]Li Z，Zhu M.Detection of pollutants in water bodies：electrochemical detection or photo-electrochemical detection？[J].Chem Commun，2020，56（93）：14541-14552.

[9]Fabre C.Advances in Laser-Induced Breakdown Spectroscopy analysis for geology：A critical review[J].Spectrochim Acta，Part B，2020，166：105799.

[10]杨宇翔.水中痕量有害重金属的LIBS-LIF超灵敏检测[D].广州：华南理工大学，2018.

[11]Bhanumathi R，Manivannan M，Thangaraj R，et al.Drug-Carrying Capacity and Anticancer Effect of the Folic Acid-and Berberine-Loaded Silver Nanomaterial To Regulate the AKT-ERK Pathway in Breast Cancer[J].ACS Omega，2018，3（7）：8317-8328.

（2021-10-25收稿 责任编辑：王明）