梁佳琦，张林辉，吴宁玲，李贵才

（南通大学1医学院；2神经再生重点实验室，江苏226001）

针对不可逆性组织的损伤，目前临床较好的治疗方法是自体移植，但存在手术创伤、并发症、供受区匹配及功能恢复不足等诸多问题[1]。组织工程可以为组织修复与重建提供理想的支架，具有良好的应用前景。采用组织工程技术制备的功能性支架能够为种子细胞的黏附、生长、增殖和分化等提供临时的机械支撑以及必要的生长环境[2]，具有高度仿生型，可用于替代、修复受损组织，重建组织功能[3]。生物支架根据其来源分为天然材料和合成材料[4]，天然材料主要有细胞外基质组分如明胶、水凝胶、壳聚糖等，这些材料虽有良好的生物相容性，适合细胞黏附，但也会带来免疫风险，带入病原体，且重复率不高，不易表观修饰。而合成材料是在严格控制条件下产生的聚合物，优点是可根据需要进行修饰加工、免疫反应少、毒性低、无病原感染风险，但其生物相容性一直是需要解决的重要问题[5]。因此，制造类似于天然生物组织的微环境仿生支架仍然是巨大挑战[6]。

近年来利用微流控技术制备生物材料微球支架逐渐成为研究热点[7]。微流控技术是指在微流控芯片中对纳升或皮升级别的微液滴进行操控处理，并将其应用于生物化学分析和微球颗粒制备的技术[8]。微球是一种微米尺寸（1～500 μm）的高分子生物材料球状或类球状聚集体，多种天然或合成高分子材料都可以制备微球，如淀粉、白蛋白、明胶、壳聚糖、聚乳酸、海藻酸等[9]。微球不仅尺寸便于调节，还可根据实际需要对不同性质的化学、生物样品实现封装药物输送[10]。另外，微球还可以为细胞和组织生长提供三维空间，在组织工程领域具有极大的应用价值[11]。水凝胶微球是一种颗粒状微米级水凝胶聚合体，在室温下为可注射流体，在体温条件下形成不易流动并具有一定支撑能力的胶体，注射后在组织损伤局部形成水凝胶达到移植目的，相比于手术移植方式更为简单安全[12]。微球间形成的间隙利于细胞浸润，便于细胞迁移、轴突生长、血管发生及营养物质的输送，为细胞生长和组织再生提供更好的微环境，加速组织损伤修复过程[13-14]。因而水凝胶微球在递送治疗药物、构建组织修复支架等生物医学领域具有广阔的应用前景[15]。

壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有良好的生物降解性、生物相容性[16]、无毒性等特点，壳聚糖分子存在众多数量的氢键，更易形成结晶区，从而具有良好的吸附性，已广泛用于食品、纺织、医疗和药物等领域[17]。由于壳聚糖具有良好的生物相容性，作为药物载体已逐渐被广泛研究。壳聚糖具有良好的成球特性，可以作为载体来控制和传输药物[18]，提高药物稳定性，易于到达病灶部位，从而达到治疗目的[19]。但是，壳聚糖也有局限性，难溶于水使其应用受到一定限制；其次，当壳聚糖分子量越大，包裹的药物浓度越高，释放药物的速率也就越低，在很大程度上限制其治疗作用。传统的微球制备方法难以包载药物，出现药物只能吸附于微球表面、释药速度减慢等问题，从而造成壳聚糖微球在生物工程方面的困难[20]。

本研究以乙酸处理的壳聚糖作为分散相，以正辛烷、Span和戊二醛作为连续相和固化相，利用微流控技术制备油包水结构的壳聚糖微球，研究分散相与固化相的速率之比、T型管管径、处理方法、液相成分、收集方法等因素对微球形态、稳定性及可注射性的影响，为壳聚糖微球支架的制备提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 试剂：正辛烷，平均分子量为114.23（上海泰坦科技股份有限公司）；Span80，平均分子量为428.6（上海泰坦科技股份有限公司）；戊二醛，平均分子量为100.12（东京化成工业株式会社）；壳聚糖（哈尔滨市兴城化工有限公司）；乙酸，无水乙醇等均为分析纯（市售）。材料：双通道微量注射泵（上海蓝德医疗器械有限公司）；T型三通管，外径1.6 mm（内径 1 mm）和外径 2.4 mm（内径 1.4 mm）（上海碧灵科技有限公司）；玻璃管，外径1.0 mm（内径 0.6 mm）和外径 1.4 mm（内径 1.0 mm）（市售）；光学显微镜（Leica，德国）。

1.2 可注射性壳聚糖微球的制备 将1 mL 5%壳聚糖、0.5 mL乙酸和23.5 mL蒸馏水混合，配成分散相溶液。将9.7 mL正辛烷、0.2 mL Span和0.1 mL 25%戊二醛混合，配成的溶液作为连续相和固化相。用1号、2号注射器分别吸取分散相和连续相，安装到双通道微量注射泵，调整流速，得到油包水结构的微球，收集于培养皿中。盖上盖子室温静置2天，得到稳定微球。见图1。

图1 可注射性壳聚糖微球制备示意图

1.3 分散相与固化相速率之比对微球的影响 在同种尺寸的T型管（2.4 mm）、相同溶液配比（分散相为乙酸酸化的5%壳聚糖溶液，连续相和固化相为9.7 mL正辛烷+0.2 mL Span+0.1 mL 25%戊二醛）条件下，仅改变分散相和连续相速率之比，分别为4∶20、4∶60、4∶100，观察所生成微球的大小和形态。

1.4 T型管管径对微球的影响 用2.4 mm和1.6 mm T型管进行速率比为4∶20的微球生成实验，溶液配比同1.3，观察所生成微球的大小和形态。

1.5 后处理方法对微球的影响 用1.6 mm T型管，溶液配比同1.3，分别以4∶300和2∶300速率之比生成2份大小均一、形态稳定的微球。在微球刚生成时、梯度换水后、梯度换水后自然风干、梯度换水后自然风干后再放入纯水浸泡30 min后对微球形态及大小观察、拍照。

1.6 液相成份改变对微球的影响 考虑到戊二醛的毒性，用4%NaOH替代25%戊二醛，在相同管径、相同溶液配比下，研究NaOH代替戊二醛的优势与劣势。将固化相和连续相的配比都改为9.0 mL正辛烷、0.8 mL Span、0.2 mL 25%戊二醛，观察生成微球的稳定性。

1.7 微球收集方法对微球的影响 微球收集采取3种方法：（1）将生成的微球保存在培养皿中直至其自然风干；（2）将蒸馏水直接倒入液相未干透的培养皿中，观察微球的形态变化；（3）将刚生成的微球放在培养皿中盖好盖子，自然风干2～3天，然后将微球连带皿中溶液收集到离心管中，放在摇床上继续固化，以避免微球与微球、微球与管壁之间粘连。16 h后用移液枪取出上层清液用于固化相和连续相的循环利用，离心管中注入无水乙醇，放到摇床上维持16 h，再用移液枪或胶头滴管取出溶液遗弃。按相同的步骤依次加入75%、50%、25%浓度的乙醇梯度换液，直至换到蒸馏水，最后直接保存在蒸馏水中。同时，将保存在蒸馏水中的微球取4∶40和4∶300的样品冻干24 h，观察冻干处理对微球形态的影响，以及不同尺寸微球受冻干的影响程度。

1.8 微球可注射性评价 在1.6 mm T型管中分别生成 4∶40，4∶160，2∶300 比例的微球，分别通过 12号、7号、6号、4.5号注射针头，其对应的内径分别为980 μm、460 μm、390 μm、270 μm，用光学显微镜观察不同微球在不同型号针头的可注射性。

1.9 微球的表征 光学显微镜观察微球的形貌，采用Origin软件统计分析微球粒径，数码相机拍摄微球形成和固化过程。

2 结 果

2.1 不同流速对微球形态的影响 在相同的T型管管径下（2.4 mm），仅改变分散相与连续相的速率之比，4∶20、4∶60、4∶100 生成的微球平均大小分别为685.7 μm，283.3 μm 和 269 μm，显微图像更直观显示，4:20生成的微球体积大，形态不整齐，内含大量大小不均气泡；4∶60生成的微球中气泡明显减少，体积较4∶20生成的微球更小，形态也不规则；而4∶100生成的微球最小，形态稳定，是标准球形。在相同管径下（2.4 mm），分散相与连续相速率之比越大，生成的微球越小。将连续相速度调快40个单位时，4∶60生成的微球远小于4∶20，而4∶100生成的微球比4∶60生成的微球直径只小了10 μm。见图2（封二）。

图2 不同流速对微球形态的影响（标尺为200 μm）

2.2 不同内径T型管对微球形态的影响 当分散相与连续相速率之比为4∶20，仅改变T型管尺寸，发现2.4 mm的T型管生成的微球体积极大，直径达685.7 μm，形状不规则，为不均匀球型，微球内部充满大量大气泡，球壁厚薄不均；而1.6 mm的T型管生成的微球体积小，直径仅92.3 μm，形态稳定、均一、规则，内部气泡少而小。见图3（封二）。

图3 不同内径T型管对微球形态的影响（标尺为200 μm）

2.3 不同后处理方法对微球形态的影响 以4∶300和2∶300的速率之比生成两组微球，每一组微球分别在刚生成时、梯度换水后、梯度换水后自然风干、梯度换水后自然风干后再放入纯水浸泡30 min后对形态及大小进行观察。显微图像显示，两组微球的形态始终稳定，呈均匀球形且无气泡生成。数据分析显示，刚生成的微球体积最大，梯度换水后微球体积缩小，自然风干后微球体积最小，但易相互粘连或者粘在皿底，不易取出应用，加水后微球体积微膨胀。见图 4（封二）。

图4 不同处理方法的微球形态（标尺为200 μm）

2.4 液相成份改变对微球形态的影响 固化相为戊二醛的微球呈现较为均匀、稳定的圆球形，速率比4∶180 时直径为 97.6 μm，4∶300 时为 85 μm；而固化相为NaOH的微球大小与戊二醛制备的微球相差不大，但不稳定，易出现破裂、絮状物溶解现象，速率比4∶180 时未成球，4∶300 时生成的微球直径为 87 μm。见图5（封二）。

图5 固化相成分改变对微球的影响（标尺为200 μm）

2.5 微球收集方法对形态的影响 将生成的微球直接泡在蒸馏水中，微球大多炸裂。自然风干后的微球呈现均匀稳定的圆球形，直径为107.8 μm，但相互粘连，不易取出。梯度换水后的微球与自然风干但未完全干透的微球大小形态相差不大，且稳定性好、流动性好，形态为均匀的圆球形，无气泡。自然风干但未干透的微球直径为141.7 μm，经梯度换水后保留在蒸馏水中的微球直径为127.7 μm。冻干的微球形态破坏，发生皱缩，直径为60 μm，即使再泡入水中30 min甚至12 h也不会恢复原来大小。见图6。

2.6 微球可注射性分析 2∶300、4∶160、4∶40 三种速率比生成的微球粒径分别为120 μm、260 μm、400 μm，均可通过内径为980 μm及460 μm的注射针头。对内径为390 μm及270 μm注射针头，粒径120 μm和260 μm的微球可以通过，400 μm的微球无法通过而破碎。当微球粒径小于针尖直径时可以顺利通过。见图7。

图6 微球收集方法对形态的影响（标尺为200 μm）

图7 微球可注射性分析（标尺为200 μm）

3 讨 论

本研究利用微流控技术，将壳聚糖用乙酸溶液处理得到水相的分散相，将正辛烷、Span和戊二醛按一定配比制得油相作为连续相和固化相，通过T型管切割出不同尺寸的油包水结构的微球。研究发现，分散相与连续相的速率之比、T型管管径、不同处理方法、微球收集方法、液相成分、注射性都是生成微球大小、稳定性、流动性的重要影响因素[21]。

根据T型管制备微球的原则，即调整分散相与连续相的速率，利用液体的力学性能在T型管两管相接处切割出形态稳定的微球，发现速率相差越大，生成的微球体积越小、越稳定[22]。由此猜想微球体积变化与速率之比呈反函数关系，因此后期开展研究时为了增强对比效果，可以考虑直接采用4∶200的速率制得更小的微球。此外，T型管管径越小，则产生的切割力越大，因此后续统一采用1.6 mm的T型管。

对刚生成的微球、梯度换水后的微球、梯度换水后自然风干的微球、梯度换水后自然风干再泡入纯水中30 min的微球进行形态对比观察，显示生成的微球形态均匀不含气泡，说明之前的微球制备方法可靠，结果稳定。其次，戊二醛作为交联剂的原理证实刚生成的微球不稳定、结合不牢固，因此体积大，而梯度换水后的微球已完全稳定，交联完全，体积变小[23]。再泡入水中后微球体积有轻微膨胀，影响不大，可能是由于水的泡发，也可能是光折射效应。

对比戊二醛和NaOH在固化相中的作用，考虑到之后的微球收集和各项表征，仍选用戊二醛作为液相中的交联剂，同时调大比例到25%，使其充分发挥交联作用，稳定微球。通过多种尝试，最后选用梯度换水的方法收集微球。梯度换水能加强微球的固化，稳定结构，防止因固化未完全而直接炸裂。考虑到该微球潜在的临床应用，我们还分析了微球的可注射性，当针管直径大于等于微球粒径时，微球可以顺利通过，而针管直径小于微球粒径时，微球无法通过而破碎。我们所制备的几种微球均能通过直径为460 μm和980 μm针头，不同尺寸的微球能通过不同直径的针头。

综上所述，本研究采用微流控技术制备油包水结构的壳聚糖微球，对微球形态、粒径、稳定性、流动性等条件参数进行研究，发现选用1.6 mm的T型管可以保证所生成微球的大小、形态满足应用要求，连续相和固化相的配比均为9.0 mL正辛烷、0.8 mL Span和0.2 mL戊二醛，既节省材料又可以使微球更加稳定。通过梯度换水的方法进行收集，所得微球的形态稳定、流动性好，具有较好的可注射性。该壳聚糖微球有望作为各种药物的包埋载体，在临床给药、组织再生等方面具有潜在应用价值。