吴小梅，贾汝汝，张 蕊，陈 蕾，朱 俐

（南通大学特种医学研究院，江苏226019）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）病因非常复杂，发生机制至今尚不完全清楚。研究发现，PD患者脑黑质内铁积聚异常明显，铁含量与PD病情的严重程度正相关[1]；铁摄入增多与PD发病危险性增加正相关，食用富铁食物人群罹患PD的危险性增加1.7倍[2]。PD患者黑质铁异常积聚除了与摄入过多有关，也可能与铁清除障碍相关。研究表明，PD发生与中枢神经系统炎症有关，小胶质细胞活化参与其中[3]。CX3CL1/CX3CR1在调控细胞趋化和粘附过程中发挥重要作用。CX3CL1主要由神经元产生，与受体CX3CR1结合后通过稳定小胶质细胞的状态，从而抑制中枢神经系统炎症反应，对神经元产生一定的保护作用[4-5]。本研究观察在PD发生过程中CX3CL1对小胶质细胞铁吸收是否有影响，旨在进一步阐明PD发生机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 将MES23.5和BV2细胞接种于10 cm培养皿、6孔或96孔培养板中，应用含10%胎牛血清的高糖DMEM（Life Technologies）培养，在细胞融合度达到80%时开始实验。MES23.5细胞分别用终浓度为75 μmol/L 6-羟基多巴胺（6-hydroxy dopamine，6-OHDA）、5 μg/mL 柠檬酸铁铵（ferric ammonium citrate，FAC）处理 12 h，然后继续培养 24 h，收集培养基备用。BV2细胞预先用CX3CL1或MES23.5细胞培养基处理24 h，或者预先用慢病毒感染72 h后再行处理，然后观察铁吸收的变化。

1.2 酶联免疫吸附试验 收集MES23.5细胞培养基，采用特异性ELISA试剂盒（Abcam公司）检测CX3CL1含量，操作步骤参照说明书。实验独立重复3次，检测结果表示为正常对照组含量的倍数。

1.3 铁吸收实验 对CX3CL1或MES23.5细胞培养基处理24 h的BV2细胞以及慢病毒感染72 h后再行处理的BV2细胞，用0.125 μmol/L钙黄绿素（Calcein-AM）于37°C孵育10 min，HEPES洗3遍去除多余Calcein-AM指示剂。收集等量细胞并混悬于2 mL HEPES溶液中，用荧光分光光度计（Shimadzu RF-5301PC，Kyoto，Japan） 以 488 nm 波长激发，518 nm发射波长检测，记录最初的荧光读数作为基数。然后加入终浓度为40 μmol/L硫酸亚铁胺（ferrous ammonium sulfate，FAS）（Sigma）混匀，立即开始读数，每5 min检测1次，持续30 min[6]。与对照组（0 ng/mL）相比，25～100 ng/mL 各组均有显著差异（P＜0.001）。实验结果以基数荧光强度的百分率表示。

1.4 统计学处理 采用Graph pad Prism 7.0统计学软件进行数据分析。计量数据以x¯±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 6-OHDA和FAC促进MES23.5细胞释放CX3CL1 分别用 6-OHDA（75 μM）和 FAC（5 μg/mL）处理MES23.5细胞12 h，然后继续培养24 h，观察其对细胞活性和趋化因子CX3CL1释放的影响。MTT法检测结果显示，与正常组相比6-OHDA及FAC处理后细胞活性显著下降；ELISA法检测结果显示，6-OHDA及FAC处理后培养基中CX3CL1水平均明显升高（图1），提示6-OHDA和FAC可促进多巴胺能MES23.5细胞释放CX3CL1。

2.2 CX3CL1对小胶质细胞铁吸收的影响 有研究证明多巴胺能神经元释放的CX3CL1可作用于小胶质细胞，引起小胶质细胞的应激反应。我们使用Calcein-AM法观察小胶质细胞对硫酸亚铁胺（FAS）吸收的变化[6]，结果显示：25、50 和 100 ng/mL CX3CL1都可使BV2细胞Calcein荧光强度下降，CX3CL1浓度越高，荧光下降越明显，与对照组比较差异均有统计学意义，提示CX3CL1可促进BV2小胶质细胞对二价铁的吸收，且呈现剂量依赖性。见图2。

图1 6-OHDA和FAC对MES23.5细胞活性及CX3CL1释放的影响

图2 CX3CL1对BV2细胞铁吸收的影响

2.3 CX3CL1通过CX3CR1介导小胶质细胞对铁的吸收 MES23.5细胞用6-OHDA处理12 h，更换培养基继续培养24 h，收集该条件培养基。BV2细胞预先感染可表达靶向CX3CR1的shRNA干扰片段的慢病毒或阴性对照病毒72 h，再用MES23.5条件培养基处理24 h，观察处理后细胞对FAS吸收的变化。从图3可以看出，6-OHDA处理的MES23.5细胞条件培养基对FAS的吸收明显多于6-OHDA未处理MES23.5细胞非条件培养基；如BV2细胞预先感染CX3CR1-shRNA慢病毒，对FAS的吸收被明显抑制。提示6-OHDA诱导MES23.5细胞释放的CX3CL1，通过位于小胶质细胞膜上受体CX3CR1发挥作用，促使小胶质细胞对二价铁的吸收。

图3 CX3CR1对CX3CL1诱导BV2细胞铁吸收的影响

3 讨 论

本研究采用多巴胺能细胞系观察6-OHDA诱导的CX3CL1对小胶质细胞铁吸收的影响。结果发现，6-OHDA和FAC自身可诱导CX3CL1的释放，通过受体CX3CR1增加小胶质细胞对铁的吸收，提示在PD发生过程中多巴胺能神经元释放的趋化因子CX3CL1可促使小胶质细胞对铁的吸收，从而降低微环境中铁的含量。

有研究发现PD患者脑黑质部位有铁沉积，PD患者黑质新鲜标本中神经元的铁含量异常增加，而且铁含量与残余多巴胺能神经元的数目无关，说明铁的异常沉积不是多巴胺能神经元凋亡后的继发性改变，而很有可能是PD原发性病因[1-2]。6-OHDA是多巴胺神经递质羟基化类似物，可被多巴胺能神经元末梢通过轴突逆转运至黑质内，造成黑质多巴胺能神经元的损伤，是常用的PD模型化学诱导剂[7]。我们成功构建了6-OHDA诱导的PD细胞模型，发现6-OHDA可诱导多巴胺能MES23.5细胞趋化因子CX3CL1的释放。有趣的是，不但6-OHDA可诱导CX3CL1释放，铁离子（FAC）自身也可诱导CX3CL1的释放。说明在PD发生过程中分泌CX3CL1，分泌到胞外的CX3CL1可介导多巴胺能神经元与脑内其他细胞间的相互作用。

小胶质细胞可被趋化因子CX3CL1激活，从而发生炎症或其它应激反应[3-6，8]。本研究结果显示，外源加入CX3CL1，BV2细胞对FAS的吸收增加，且呈剂量依赖性，提示CX3CL1对小胶质细胞铁吸收有诱导作用。如果预先用6-OHDA处理MES23.5细胞的条件培养基孵育BV2细胞，则BV2细胞对铁的吸收也增加，提示条件培养基中的CX3CL1可能发挥了重要作用。非常有意义的是：对BV2细胞预先感染慢病毒，干扰CX3CR1的表达，则MES23.5细胞条件培养基对铁吸收的诱导作用被抑制。上述结果证明，6-OHDA可诱导多巴胺能神经细胞释放CX3CL1，其通过位于受体细胞膜上的CX3CR1增强小胶质细胞对铁的吸收，从而降低细胞微环境中铁的含量。

总之，本研究首次将多巴胺能神经元释放的CX3CL1与小胶质细胞铁吸收结合起来，即从脑内神经元和胶质细胞相互作用的角度，证明PD损伤过程中多巴胺能神经元释放的CX3CL1可作用于小胶质细胞，促进其对铁的吸收，从而调节细胞微环境，为阐明PD发生机制和寻找有效的药物靶标提供新的理论依据。