蒋 伟，管程齐 ，朱惠君，毛振彪 ，张健锋

（南通大学附属医院1急诊内科；2消化科；3病理科，江苏226001）

尾型同源盒转录因子2（caudal-type homeobox transcription factor 2，CDX2）是一种肠特异性核转录因子，在淋巴结转移或远处转移的胃癌患者肿瘤组织中CDX2表达降低或缺失，提示CDX2表达下调与不良预后相关[1]。我们前期预实验发现，通过上调CDX2表达能抑制胃癌细胞生长，降低其迁移侵袭能力，miRNA芯片筛选发现上调miRNA-32基因表达亦可抑制胃癌细胞增殖和迁移[2-3]。本研究通过检测胃癌组织中CDX2和miRNA-32的表达，分析两者表达的相关性及其与临床病理参数的关系，探讨CDX2表达对患者术后预后的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2014年1月—11月我院胃肠外科手术切除的50例胃癌组织及远癌组织标本，远癌组织标本取自距癌组织5 cm以上近侧断端胃黏膜，采集后立即放入液氮速冻后转至-80℃冰箱保存备用。50例胃癌患者中女性16例，男性34例；年龄＜60岁27例，≥60岁23例；肿瘤直径≥5 cm 16例，＜5 cm 34例；淋巴结转移31例，无淋巴结转移19例；TNM临床分期Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期32例；肿瘤未浸润浆膜层11例，浸润浆膜及以外39例；低分化腺癌31例，高-中分化腺癌19例。病例纳入标准：（1）胃癌D2根治术患者，术后病理诊断为腺癌；（2）切缘无肿瘤细胞残留；（3）术前未行新辅助放、化疗，术后行XELOX方案化疗6个周期；（4）无长期服用非甾体类抗炎药、皮质激素史。采用门诊随访和电话随访，随访时根据病情选择检查肿瘤标志物、胃镜、B超、CT或者MRI等项目。从手术日开始术后第1年每3个月随访，术后2～5年每6个月随访。本研究方案经院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂和仪器TRIzol（美国Invitrogen公司），SYBR Green mix（Rox）（瑞士 ROCHE 公司），Revert Aid TM First strand cDNA Synthesis kit（美国Thermo公司），CDX2抗体和荧光二抗（美国Abcam公司）。超低温冰箱（日本SANYO公司），显微镜（日本Olympus公司），离心管等耗材（美国Corning公司），PCR扩增仪和凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化技术检测CDX2蛋白表达：石蜡切片脱蜡水化后微波修复抗原，3%过氧化酶阻断内源性过氧化物酶活性。非免疫动物血清封闭内源性抗体，除去血清，滴加CDX2一抗（稀释浓度为1∶100），室温孵育60 min。PBS冲洗后加二抗，室温45 min。PBS冲洗后加 3，3′-二氨基联苯胺溶液（DAB）显色，自来水冲洗后苏木素复染2 min，封片，显微镜下观察、摄片。结果判读[4]：计算阳性细胞数：0～5%染色阳性细胞记 0，6%～25%记 1，26%～50%记 2，51%～75%记3，76%～100%记4。着色强度：不着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3。两者分数相加，最终结果判定：评分 0～2为（-），3～7为（+）。

表1 CDX2、内参β肌动蛋白、miRNA-32及U6引物序列

1.3.2 实时荧光定量PCR检测CDX2和miRNA-32表达：通过Primer Primier 5.0软件设计CDX2和内参β肌动蛋白引物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miRNA-32及内参U6引物委托上海睿安生物科技有限公司设计、合成。引物序列见表1。称取解冻后组织标本40～60 mg，应用TRIzol法提取组织总RNA，随后应用Thermo Scientific RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA。反应体系：RiboLock TM Ribonuclease Inhibitor 1 μL，5× reaction buffer 4 μL，RevertAid TM M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，10 mmol/L dNTP mix 2 μL，DEPC水加至20 μL。CDX2和β肌动蛋白反应体系：SYBR Green mix（ROX）10 μL，上游引物和下游引物各 0.6 μL，cDNA3 μL，DEPC 水 加至 20 μL。miR-32 和 U6 反应体系：SYBR Green mix（ROX）10 μL，上游引物和下游引物各 1 μL，cDNA3 μL，DEPC 水加至 20 μL。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，56 ℃ 60 s，40 个循环。结果判断[5]：采用比较Ct法进行相对定量分析，以ΔΔCt值表示目的基因相对表达量，ΔΔCt=（样品Ct均值-内参Ct均值）-（对照样品Ct均值-对照内参Ct均值），取2-△△Ct即代表被检样品初始样本mRNA相对含量。

1.4 随访 采用门诊随访和电话随访，术后第1年每3个月随访，术后2～5年每6个月随访。根据病情选择肿瘤标志物、胃镜、B超、CT或MRI等检查。观察残胃复发、远处转移和生存期。

1.5 统计学处理 运用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析。正态分布的计量资料以x¯±s表示，组间比较采用配对t检验，偏态分布的计量资料以中位数和范围表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；计数资料以频数和率表示，组间比较采用χ2检验，当理论频数＜5时，采用Fisher确切概率法；CDX2mRNA与miR-32相关性分析采用Pearson系数；采用Kaplan-Meier法进行生存分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

图1 胃癌组织中CDX2蛋白表达和定位（200×）

表2 胃癌组织CDX2蛋白表达与临床病理参数的关系 例（%）

2.1 CDX2蛋白表达与胃癌患者临床病理参数的关系 免疫组化结果显示，50例胃癌组织中29例CDX2蛋白表达阳性，阳性率（58.0%），阳性表达主要定位于肿瘤细胞核中（图1）。胃癌组织CDX2蛋白阳性表达率淋巴结转移患者为45.2%，临床Ⅲ～Ⅳ期患者为46.9%，分别低于无淋巴结转移患者的78.9%和临床Ⅰ～Ⅱ期患者的77.8%，差异均有统计学意义（P＜0.05)；而与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化、浸润深度等因素无关（P＞0.05）。见表2。

2.2 胃癌组织CDX2蛋白表达与患者预后的关系 随访显示本组50例胃癌患者术后1年、2年、3年、4年和5年累计复发率分别为28.0%（14/50）、60.0%（30/50）、80.0%（40/50）、88.0%（44/50）和94.0%（47/50），术后5年累计死亡率为86.0%（43/50）。与CDX2阳性患者比较，CDX2阴性患者术后各年度累计复发率较高，术后2年和3年的复发率高于CDX2阳性患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），5年生存率低于CDX2阳性患者，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。CDX2阳性患者复发时间5～60月，中位复发时间38月；CDX2阴性患者复发时间2～58月，中位复发时间15月，两组中位复发时间差异性比较具有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图2。

表3 胃癌患者术后累计复发率比较 例（%）

图2 不同CDX2蛋白表达水平患者生存曲线比较

2.3 CDX2 mRNA和miRNA-32在胃癌组织中表达及其与临床病理参数的关系 RT-PCR结果显示，CDX2 mRNA和miRNA-32在胃癌组织中表达高于远癌正常胃组织，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。与未侵及浆膜、无淋巴结转移和临床Ⅰ～Ⅱ期患者比较，侵及浆膜外、淋巴结转移和Ⅲ～Ⅳ期患者CDX2mRNA和miRNA-32表达明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Pearson相关系数分析显示，胃癌组织中CDX2 mRNA与miRNA-32表达水平呈正相关，差异具有统计学意义（r=0.861，P＜0.05）。见表 4，图3。

表4 CDX2 mRNA和miRNA-32在胃癌组织中表达与临床病理参数的关系

图3 胃癌组织中CDX2 mRNA和miRNA-32表达相关性散点图

3 讨 论

最新数据报道，我国胃癌发病率和死亡率在肺癌之后居所有肿瘤第二位[6-7]。侵袭转移是胃癌患者不良预后的主要因素之一，探索和阐明胃癌转移的分子机制对预防、治疗和改善患者预后等具有重要意义。

本组50例胃癌患者中，CDX2蛋白阳性表达率为58.3%，淋巴结转移和Ⅲ～Ⅳ期临床进展期患者CDX2表达阳性率明显下调，CDX2阴性患者术后1～5年的年度累计复发率明显高于阳性者，术后中位复发时间和生存期均明显短于CDX2阳性患者，提示CDX2表达阴性与胃癌患者病情进展和5年生存率降低有关。然而，CDX2表达下调或缺失影响胃癌患者预后的分子机制尚未阐明。

文献报道，在恶性肿瘤发生、发展过程中，转录因子可以靶向调控miRNA的表达而影响下游基因群的功能，是构成机体复杂基因表达调控网络的重要组成部分[8-9]。本研究相关性分析显示CDX2 mRNA与miRNA-32在胃癌组织中的表达呈显著正相关，在浆膜外侵犯、淋巴结转移和临床Ⅲ-Ⅳ期等进展期患者中两者表达水平降低，提示CDX2和miRNA-32表达下调或缺失可能预警患者进展期临床状态。近期有报道，miRNA-32通过靶向E2F转录因子5抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示miRNA-32对结肠癌可能发挥抑癌基因功能[10]。我们前期工作也提示，上调miRNA-32表达能明显抑制胃癌细胞恶性表型，提示miRNA-32可能在胃癌进程中起着抑癌基因功能[3]。然而，CDX2是否直接靶向调控miRNA-32有待进一步研究。

综上所述，联合检测胃癌组织中CDX2和miR-NA-32表达水平，分析两者与淋巴结转移、临床分期、术后复发、生存时间等关系，可能为临床判断胃癌预后提供新的分子靶点。