脯氨酰内肽酶的研究进展

2021-01-19齐晓艺封龙宽王少雄孙炜王晓萌檀建新

生物化工 2021年5期

齐晓艺，封龙宽，王少雄，孙炜，王晓萌，檀建新

（河北农业大学食品科技学院，河北保定 071000）

脯氨酰内肽酶（Prolyl Endopeptidase，PEP）是由WALTER等[1-2]首先发现的一种高度保守的丝氨酸蛋白酶，也被称为脯氨酰寡肽酶或脯氨酸后裂解酶[3]，存在于许多植物、哺乳动物、细菌和真菌中[4-5]。PEP是一种特异性水解酶，只能切割少于30个氨基酸的肽底物和水解肽片段[5]，有可能优先切割脯氨酸残基羧基侧的肽，其次是亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸。近年来，大量学者对PEP酶学特性、作用机制、异源表达和分子改造等特性以及应用等方面进行了相当多的研究。本文以“prolyl endopeptidase”“作用机制”“异源表达”等为关键词，根据知网、Web of Science和Science Direct等数据库搜索结果，从作用途径或物质基础的角度综述了PEP功能活性研究进展，为PEP在食品、医药领域中的进一步开发利用提供理论依据。

1 酶的来源

脯氨酰内肽酶（PEP，EC3.4.21.26）广泛分布于植物、哺乳动物、细菌和真菌中，不同来源的酶在相应生物体中发挥着不同的作用[4-5]。迄今为止，在曲霉属中只有2种产脯氨酰内肽酶：黑曲霉和烟曲霉，且只有黑曲霉是食品级微生物[4]。不同于来自其他微生物或哺乳动物的PEP，来自于黑曲霉的PEP具有切割大分子蛋白质的能力，且不需要任何其他具有广泛特异性蛋白酶活性的预水解步骤[6]。

2 酶学性质

2.1 霉菌产生酶

目前，利用霉菌产生PEP的工艺已经得到了广泛的研究。ESPARZA等[7]研究黑曲霉ATCC 11414发酵PEP的工艺，构建了固态发酵（SSF）生产PEP的系统。在SSF生产PEP过程中得出，PEP酶的最适温度为50 ℃，固态发酵168 h后PEP活性最高，为（9.76±0.06）U/kg；在pH值为4时酶活力最高，在pH值为3和pH值为5时酶活力分别为最大酶活力的60%和70%。与其他曲霉菌株产生的酶一样[8]，这种酶具有最适的酸性pH值，这是区别真菌PEP和细菌PEP的重要指标。

2.2 动物产生酶

研究表明，动物产生PEP有利于进一步探究其酶学性质和作用机制。LI等[5]成功克隆了重组鲍鱼脯氨酰内肽酶基因（rHdh-PEP）全长，通过肽质量指纹图谱、酶学性质等分析方法表明，rHdh-PEP的最适pH值为6.0，最适温度为20 ℃。其他研究表明，鲤鱼PEP的最适温度为35 ℃；PEP在40 ℃以下较稳定，当温度超过45 ℃时，其活性急剧下降[9]。这说明PEP对温度极其敏感，温度是影响其活性的关键因素。

3 PEP的作用机制

从蛋白的结构和作用机制来看，PEP是相对不寻常的丝氨酸蛋白酶，仅能在脯氨酸残基的羧基端特异性地切割短肽[10]。PEP的X射线晶体结构由FÜLÖP等人[11]于1998年首次从猪脑中获得，实验结果表明PEP具有一种特殊的双结构域，包括一个较小的α/β-水解酶结构域和一个不常见的β-螺旋结构域。脯氨酰内肽酶家族在底物特异性上有很大差异[12]，但都具有这个相同的双结构域。该家族的肽酶采用了复杂的机制来调节和筛选可进入埋藏的活性部位的底物，允许较小的肽段进入活性部位空腔，同时排除较长或结构化的肽，防止非靶向消化[13]。

LU等[12]对囊鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas capsulata，SC）和黄色粘球菌（Myxococcus xanthus，MX）两种来源的PEP进行结构和机理分析，揭示了PEP家族中一种独特的酶与底物结合模式：进入的肽底物会诱导酶的构象变化并导致结构域界面打开，开放的PEP结构通过底物和酶的催化结构域之间的相互作用暂时稳定，同时发现残基Arg-618和Asp-145有助于酶独特的底物特异性和活性。

4 PEP的分子改造与异源表达

目前，工程酶常用的策略之一是定向进化，这是相当盲目和低效的。 PEP对脯氨酸残基羧基端切割底物肽具有很高的特异性[14]，为克服这一功能发挥的局限性，而采用了另一种策略，即分子改造和异源表达[15]。HUG等[16]通过靶向基因失活实验和相关酶的体外生化表征，在链霉菌中通过靶向基因失活和外源表达确认了脯氨酰内肽酶生物合成基因在Cittilins（粘细菌的次级代谢产物）形成中的作用。毕赤酵母作为一种甲基营养酵母，已经在学术界和工业界发展成为一种非常成功的外源蛋白表达系统[17]，YU等[18]研究发现，重组菌株转录组的3个新的辅助基因（FES1、CPR6和STI1）的共同过表达成功地提高了包括脯氨酰内肽酶在内的两种酶在毕赤酵母中的产量，其产量比对照组增加了1.41倍。LASSE等[19]研究了在大肠杆菌中制备的婴儿利什曼原虫脯氨酰内肽酶（rPEPLi），实验结果表明rPEPLi作为一种婴儿利什曼原虫的毒力因子，为设计新的抗婴儿利什曼原虫药物提供了潜在的靶点。

5 PEP的应用

已有研究证明PEP对蛋白水解物具有脱苦作用[20]，可防止啤酒混浊的形成，同时能降解富含脯氨酸的蛋白质从而消除面筋[21]，以及缓解肝病症状等功能[22]，目前已广泛应用于医学和食品领域。

5.1 医学中对疾病的抑制作用

PEP广泛分布在身体各个部位，大量的证据表明PEP参与炎症和氧化应激过程，对疾病治疗具有深远意义[23-24]。WEI等[25]认为PEP等酶通过切断谷氨酰胺和富含脯氨酸的区域，抗原性麸质肽的特征区域，在体内和体外裂解抗消化的面筋肽，且在胃的酸性环境和十二指肠内接近中性的环境中可以稳定、活跃地存在，以此解决轻微症状或严重的吸收不良造成的乳糜泻症状。ZHANG等[26]发现PEP破坏可以减轻蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）诱导的肝脏炎症，同时减少了炎性细胞的浸润和炎性介质的分泌，更重要的是，靶向PEP可以改善MCD小鼠的氧化应激状态，其可能是NAFLD/NASH新的潜在治疗选择。还有研究证明PEP可以抑制乳腺癌肿瘤[27]、脑膜炎[28]等疾病，在医学中应用较为广泛。

5.2 食品中对饮品的澄清作用

食品级的PEP具有最佳的酸碱度水平，对饮品具有澄清作用[29]。对于富含蛋白原料的发酵酒，容易形成由多酚和脯氨酸等组成的聚集体浑浊，因此在前处理阶段和啤酒酿造的稳定阶段使用一些能分解蛋白质的酶，如脯氨酰内肽酶，可以有效去除沉淀的聚集体以达到澄清效果[30]。张杰等[31]把不同酶活的PEP梯度添加到小麦啤酒生产过程的不同阶段，研究其对小麦啤酒非生物稳定性及泡沫稳定性的影响，发现在发酵前添加42 U/mL的PEP可显著降低小麦啤酒的非生物浑浊，且不影响发酵整体性能及泡沫稳定性，为生产优质的小麦啤酒提供了新的思路。