陈思琦

（江西医学高等专科学校 医学技术学院检验教研室，江西上饶 334000）

蚊媒传染病是危害人类健康的重要疾病之一，是全球面临的重要公共卫生问题[1]。作为主要的媒介生物，伊蚊和按蚊通过叮咬吸血，可传播包括流行性乙型脑炎、登革热和疟疾在内的多种疾病[2]。由于一直缺乏有效的特异性疫苗，过去针对蚊媒传染病的防控多以化学杀虫剂为主。近年来，杀虫剂大量长期的使用导致蚊虫耐药性增强，残留的化学药物还造成了生态环境的污染，生物防治蚊虫手段开始受到人们关注。沃尔巴克氏体（Wolbachia）是一种广泛分布于节肢动物体内的共生菌，已证实其可以一定程度上调控宿主的生长与繁殖，还能通过激活多种免疫相关基因和天然免疫通路抑制或阻断宿主对登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗病毒（WNV）、疟原虫等多种病原体的感染[3-5]。Wolbachia作为一种新型的区域性蚊媒传染病防控方式，逐渐成为生物防治蚊媒传染病的研究热点。

1 Wolbachia激活经典免疫途径抗病毒感染

1.1 Wolbachia调控NF-κB（Toll和IMD）通路

存在于昆虫内的Toll和IMD天然免疫通路，是与哺乳动物NF-κB信号通路非常相似的两条通路。与哺乳动物的类Toll受体不同，节肢动物的Toll受体不是模式识别受体（PAMPs）介导，而是由细胞外可溶性模式识别受体介导的[6]。Toll通路最早在果蝇体内发现，被证实能有效抵御革兰阳性菌、真菌和病毒侵袭，而IMD通路常在革兰阴性菌感染时被激活，两条通路均能介导抗微生物多肽（AMPs）的产生[7-8]。

对于不同的微生物，AMPs的杀灭模式通常是特定的。比如，防御素（Defensins，Def）通过破坏膜通透性屏障，对革兰阳性菌和寄生虫产生高度毒性，导致其活性降低[9]；而带正电荷的抗菌肽（Cecropins，Cec）通过与带负电荷的膜脂质结合，进而改变膜的生物结构，其起作用的模式可能包括抑制核酸和蛋白质合成以及抑制酶活性[10]。

已有文章证实，wAlbB型Wolbachia感染埃及伊蚊后，会诱导NADPH氧化酶和活性氧簇（ROS）的升高，导致Toll通路组分如GNBPB1、Spaetzle 3（SPZ3）、髓样分化原发反应基因88（MYD88）和REL1A的激活，而IMD通路的标记基因IMD、肽聚糖识别蛋白LB（PGP-LB）和LE（PGRP LEP）则下调[11]。

TOLL通路的激活介导了AMPs的抗氧化作用，同时产生Cec和Def[12]。其中，在WB1型埃及伊蚊的中肠中，Cec B和Def C的表达水平都上调了2.5倍以上。wAlbB型菌株抑制了登革病毒在蚊子中肠中的复制及其在蚊体胸腔和头部中的传播，显著降低了蚊子传播病毒的可能性[13]。

1.2 Wolbachia激活RNAi

在昆虫体内，RNAi途径在抗病毒防御中起着关键作用，尤其是外源siRNA途径[14]。简单来说，dsRNA特异性RNA酶（Dicer2）通过识别并将病毒dsRNA切割为siRNA片段，siRNA与Dicer酶和Argonaute蛋白等多种生物大分子装配成RNA诱导沉默复合体（RISC），破坏并切割其互补的mRNA靶点，最终降解病毒的RNA[15]。果蝇体内siRNA通路功能丧失或某些成分的突变，被证明会增加其对RNA病毒感染的易感性。

尽管基孔肯雅病毒、登革病毒等黄病毒为正链ssRNA病毒，但也可检测到dsRNA作为复制中间产物产生[16]，从而激活RNAi途径，参与昆虫对虫媒病毒的免疫应答[17]。同时，有文章证实，除了RNA病毒，大肠杆菌等细菌体内也会产生dsRNA[18]，结合Wolbachia是一种专性细胞内寄生菌的生物本质，其是否也能产生dsRNA从而激活RNAi途径增强抗病毒功能，是亟待研究的课题。

现阶段的研究已经发现，在Wolbachia感染的埃及伊蚊体内，RNAi途径关键因子AGO2的水平明显增高，与之相对应的，通过siRNA技术敲低AGO2之后，其抗病毒能力有所下降[19]。但是，对于Wolbachia的天然宿主果蝇来说，虽然携带Wolbachia使其对RNA病毒（如果蝇C病毒）的抵抗增强，其抗病毒过程并不依赖RNAi通路[20]。

1.3 Wolbachia调控ERK-MAPK途径

丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在生物进化过程中具有高度保守性，不论在低等原核细胞或高等哺乳类细胞内，对细胞的增殖、分化、转化及凋亡等过程都具有至关重要的作用[20]。

细胞外调节蛋白激酶（ERK）是MAPKs信号通路家族中的一个重要信号通路，其在病毒感染致病以及宿主防御过程中具有重要作用。果蝇体内ROS水平的增加与其对病毒感染的耐受性和Wolbachia介导的抗病毒保护有关，Wolbachia感染后，果蝇体内ROS表达明显高于野生组，同时导致ERK通路的磷酸化水平也增加了2倍以上。通过构建ERK通路功能丧失的果蝇突变体，研究者发现，在果蝇细胞和成虫的肠道上皮细胞抵抗果蝇C病毒（Drosophila C Virus，DCV）复制和侵袭的过程中，ERK-MAPK信号转导途径发挥了重要作用[21]，同时，当ERK通路激活受损，也在一定程度上影响了其他上皮抗病毒免疫通路（如IMD通路）的激活。

2 Wolbachia抗虫媒病毒感染的其他机制

2.1 Wolbachia抑制胰岛素受体（InR）

胰岛素信号级联途径在调节真核生物的生长、发育、变态、雌性生殖能力和寿命方面都发挥着重要作用，并且该途径从酵母到哺乳动物都是保守的[22]。最早发现并克隆的类胰岛素样多肽（ILP）来自家蚕的Bombyxmori基因，目前已陆续鉴定出了32个家蚕素（Bombyxin）家族基因，共可分为7个亚家族（A-G subfamiliy）[23]。通过同源进化分析发现，果蝇体内有7种胰岛素样肽（DILPs），类似于人类胰岛素多肽[24]。同时，在埃及伊蚊、冈比亚按蚊体内也发现了多种类胰岛素样多肽，这些多肽与蚊子的吸血、发育、繁殖等行为关系紧密[25-26]。但每种昆虫体内证实的胰岛素受体（InR）只有一种，ILPs中是否只有几种或都与InR结合还未阐明清楚[27]。由于Wolbachia对蚊体的生长生殖都有显著的影响，其是否能通过影响胰岛素信号级联通路，增强其抗病毒功能，是研究者很感兴趣的问题。

Kinexus抗体微阵列结果显示，在Wolbachia感染后，蚊体内117种细胞因子的表达或磷酸化水平产生了显著差异，其中28种磷酸化特异性识别位点信号上调、64种下调，Wolbachia阳性的细胞中InR丰度和磷酸化水平都有明显降低。同时，有文章已经证实，在哺乳动物细胞中登革病毒的复制需要InR的帮助[28]，InR基因的敲减能明显降低哺乳动物中DENV的复制。基于前期理论基础，研究人员利用siRNA基因敲减技术和药物阻断方法对InR在ZIKV和DENV复制中的作用进行了表型验证，证实通过Wolbachia介导的胰岛素受体激酶活性下调是埃及伊蚊阻断虫媒病毒感染的机制之一[29]。

2.2 Wolbachia调控非编码RNA（Non-coding RNA）

非编码RNA广义上指的是不编码蛋白质的RNA，而昆虫体内比较常见的是长度小于50 nt的非编码小RNA主要有3种：siRNA、miRNA和piRNA[30]。以miRNA为例，阐述Wolbachia调控的相关研究进展。

miRNA靶点的预测可以通过生物信息学的方法进行，并且常常会产生数百个潜在的靶基因，使得功能性特征复杂化。另外，一个miRNA可以靶向多个基因，一个基因可以被多个miRNA调控，增加了研究的难度。在蚊子体内，miRNA被证明可以调节发育、消化和繁殖等多种生理过程。迄今，也有不少研究证实在病毒感染昆虫的反应中，miRNA起到了转录调控的作用[31-32]。

在新近感染Wolbachia的埃及伊蚊体内，研究者通过筛选发现一种名为aae-miR-2940的miRNA只在感染沃尔菌的蚊子中大量表达，同时下调一种DNA甲基转移酶（AaDnmt2）的表达。AaDnmt2属于胞嘧啶甲基转移酶家族2，是昆虫中保存最古老、分布最广的基因，也是双翅目生物中发现的唯一一种DNA甲基转移酶[33]。胞嘧啶甲基化有非常重要的生物学功能，包括宿主防御、基因组稳定性、促进器官发育和寿命调控等[34]。更值得关注的是，在蚊子体内引入Wolbachia，会抑制AaDnmt2的表达，而登革病毒则诱导AaDnmt2的表达升高。相反，在蚊细胞中过表达AaDnmt2能显著促进登革病毒的复制，表明aae-miR-2940与Wolbachia阻断蚊子体内登革病毒复制之间存在因果关系。

而作为Wolbachia的自然宿主，果蝇在抵御DCV的过程中虽然产生了大量的miRNA，但其中17种黑色素菌相关的miRNA丰度均不受Wolbachia感染的影响，也不受Wolbachia和DCV双重感染的影响。同时，单独感染Wolbachia与Semliki森林病毒（SFV）共感染的果蝇细胞miRNA表达谱也没有差异，表明miRNA不参与果蝇体内Wolbachia抗病毒的机制。

3 讨论和展望

昆虫在遭遇病原体的侵袭过程中，体内存在的天然免疫系统发挥了重要的防御和抵抗作用。通过诱导一系列免疫信号级联通路磷酸化，如Toll、IMD、JAK/Stat通路等，激活抗菌肽或其他免疫因子的转录，发挥抗病原体侵袭效应。

作为一种蚊虫体内寄生最广泛的胞内共生菌，Wolbachia具有强大的抗病毒效应，基于其生物特性开展的一系列地区性生物防治蚊媒传染病实验也得到了令人满意的效果，但其具体的抗病毒机制还有待进一步研究和明确。

现阶段的研究表明，在Wolbachia新近感染蚊虫后，其体内的免疫激活状态会发生显著改变，对许多经典抗病毒通路都有一定的激活，也产生了一系列抗菌肽或防御素来对抗病毒，但相比未感染的蚊虫，这些通路发挥的抗病毒功能并不显著，可能并不是Wolbachia抗病毒过程中所必需的。

尽管Wolbachia介导的病原体阻断机制还未阐明，但已有多项研究表明其与宿主的免疫反应有关，通过转录组、蛋白质组数据的分析，人们对Wolbachia在昆虫病原体防御中发挥的作用有了更深的了解。在病毒-Wolbachia-宿主三者之间一定有特别的关联，是调节Wolbachia感染宿主与宿主抗病毒效应之间的机制的核心。而今后的研究重点不应该局限于蚊虫体内原有的经典天然免疫通路，更多地将目光放在Wolbahcia自身基因组与代谢组学上，探究其在感染蚊虫以及遭遇病毒侵袭后，生物特性和分泌能力发生的变化，或许会带来新的观点和发现。