吴海兰 李才武 李 果 潘 欣 邓雯文张贵权 何永果 黄 炎 张和民 邹立扣

(1.成都理工大学旅游与城乡规划学院，成都，610059；2.中国大熊猫保护研究中心大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草原局重点实验室，都江堰，611830；3.四川农业大学资源学院，成都，611130)

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)在长期进化过程中已特化出以竹类为食的特点，它们虽有着草食性哺乳动物的进食特点，但仍保留着典型肉食性动物的消化系统，其本身不能产生纤维素酶，也不具有编码纤维素酶的相关基因[1]。因此，消化竹子的木质纤维素的功能需依赖其肠道微生物来完成。短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是由肠道微生物发酵膳食纤维、碳水化合物和其他植物营养素在肠道中形成的碳原子数为1—6个的饱和脂肪酸，主要包含甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异己酸等[2]。研究表明，SCFAs不仅能促进宿主对营养物质的消化吸收，还能降低肠道pH值，抑制致病菌的定植，促进结肠上皮细胞增殖，维持肠道完整性和调节肠道免疫等功能[3-4]。SCFAs的种类、数量主要取决于肠道内菌群组成、消化的时间、宿主饮食中的纤维含量以及外源摄入的SCFAs。机体内产生的SCFAs一部分被吸收入血液，通过血液循环参与机体内各组织代谢，这是机体从小肠不能直接消化的碳水化合物中获取能量的主要途径，仅有少部分(约占总量5%—10%)逃脱吸收随粪便排出[5]。现有关大熊猫肠道研究中更多地侧重于肠道微生物菌群、纤维素酶活性等，尚有关大熊猫肠道中短链脂肪酸的相关研究。

目前，关于测定样品中SCFAs含量的方法多种多样，包括高效液相色谱(HPLC)结合紫外(UV)检测[6]、电化学检测(ECD)[7]、质谱(MS)[8]或气相色谱(GC)结合火焰离子化检测(FID)[9]和质谱法(MS)[10]。在这些方法中，GC/MS法是生物样品中最常用的SCFAs测定方法，具有较高的灵敏度。SCFAs极性较强，未衍生化的SCFAs在气相色谱柱中容易产生吸附作用，最好进行衍生化样品预处理，以降低这些挥发性酸的蒸发损失，提高其准确度和分离度[11]。

本研究对提取了竹子、大熊猫血清及粪便样本中SCFAs，利用气相色谱-质谱联用(GC/MS)方法对苦竹、大熊猫粪便以及血清中SCFAs进行检测，研究发现苦竹不同部位SCFAs的含量存在明显差异。大熊猫采食竹子不同部位，其所含的SCFAs的含量不同，可对肠道以及机体发育产生一定的生理作用。

1 材料与方法

1.1 样品采集

收集苦竹(Pleioblastusamarus)样本共9个，包括竹叶、竹笋和竹竿各3个(每个样本由3个样品混合均匀)；圈养大熊猫新鲜粪便样本6个，血清样本3个。

1.2 试剂

甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸、戊酸、2-甲基戊酸、4-甲基戊酸、正己酸、正庚酸和磷酸氢二钠购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。乙酸-d4同位素购买于剑桥同位素实验室公司。2，3，4，5，6-五氟溴苄(PFBBr)、丙酮和正己烷购于西格玛-奥德里奇公司。

1.3 短链脂肪酸提取和衍生

样本用液氮研磨成粉末，称取50 mg左右的竹笋(或竹叶或粪便或100 mg的竹竿)，加入170 μL水、30 μL的0.5M的Na2HPO4溶液、100 μL的100 μg/mL乙酸-d4内标溶液和600 μL的PFBBr丙酮溶液。60℃水浴反应40 min。反应结束后，加入200 μL的正己烷。3 000 g离心15 min，移取上层正己烷相进行气相色谱-质谱分析。

取100 μL解冻的血清样本，加入70 μL水、30 μL的0.5 M的Na2HPO4溶液、100 μL的100 μg/mL乙酸-d4内标溶液和600 μL的PFBBr丙酮溶液。60℃水浴反应40 min。反应结束后，加入200 μL的正己烷。3 000 g离心15 min，移取上层正己烷相进行气相色谱-质谱分析。

1.4 标准曲线制备

制备1 mg/mL的水溶液的12种短链脂肪酸混标，梯度稀释得到0.001—0.500 mg/mL混标溶液。取20 μL梯度稀释的混标、加入150 μL水、30 μL的0.5 M的Na2HPO4溶液、100 μL的100 mg/mL乙酸-d4内标溶液和600 μL的PFBBr丙酮溶液。余下步骤同样本制备。

1.5 气相色谱-质谱检测分析

采用美国安捷伦公司的气相色谱质谱联用仪(型号7890A/5975C)和德国MACHEREY-NAGEL公司 OPTIMA WAXplus®熔融硅毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)对衍生的样本进行短链脂肪酸定量检测分析。载气为高纯(纯度大于99.999%)氦气，流速1 mL/min。采用梯度升温程序对样本进行分离分析。梯度升温程序为：起始炉温为60℃并维持2 min，以20℃/min升到100℃，以2℃/min升到110℃，以10℃/min升到160℃，继续以20℃/min升到240℃并维持2 min。样本以无分流模式进样1 μL，溶剂延迟时间设定为9 min。进样口、传输线和电子碰撞(EI)电离源温度分别设定为250℃、250℃和230℃。EI能量设定为70电子伏。采用选择离子模式对数据进行采集。

2 结果与分析

2.1 SCFAs色谱图

将样品按照上述色谱条件下进行测定，确定各种酸的保留时间以及定量离子质荷比，结果如表1所示。样品中12个短链脂肪酸分别是甲酸、乙酸、异丁酸、丙酸、2-甲基丁酸、丁酸、异戊酸、2-甲基戊酸、戊酸、己酸、庚酸、4-甲基戊酸。SCFAs总离子流图谱如图1所示，能够同时分离12种不同的SCFAs，且在图谱中分离良好，内标物乙酸-d4与其他目标峰位相近且分离度良好，互相之间无干扰，适合SCFAs 的分离和鉴定。

2.2 定量分析方法学考察

将12种SCFAs配制成不同级别的混合标准溶液，以标准品浓度x(μg/mL)为横坐标，以对照品与内标物的峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线，通过绘制所得的曲线进而得到线性相关系数，结果如表2所示。各标准品峰面积与浓度线性关系良好，相关系数均达到0.999，相对标准偏差为5.12%—8.82%(n=6)。

表1 12种短链脂肪酸的保留时间Tab.1 Retention times of 12 short-chain fatty acids

表2 12种短链脂肪酸的线性回归方程，相关系数，线性范围和相对标准偏差Tab.2 Linear regression equation，correlation coefficient，linear range and relative standard deviation of 12 kinds of short-chain fatty acids

续表2

2.3 竹子中SCFAs含量

采用该方法进一步测定苦竹、大熊猫粪便和血清样品中的SCFAs含量，4-甲基戊酸含量在定量限以下，各样本中难以检测出。苦竹所有样本中检测到的主要SCFAs包括乙酸、甲酸、正己酸和丙酸，其平均含量分别为61.39、42.06、8.43和6.30 μg/g(图2A)。从表3可以看出SCFAs在苦竹不同部位中的分布存在明显差异，除竹笋中异丁酸、2-甲基丁酸、丁酸、异戊酸的含量较竹叶和竹秆高外，其余SCFAs都以竹叶中含量较高，竹秆中各SCFAs含量都较低(图2B)。

表3 苦竹不同部位中SCFAs的含量Tab.3 Content of SCFAs in different parts of bitter bamboo

续表3

2.4 大熊猫粪便中SCFAs含量

粪便样品中检测到的主要SCFAs包括乙酸、甲酸、丙酸、异丁酸和丁酸，其平均含量分别为152.37、61.76、3.92、1.11和0.88 μg/g；2-甲基戊酸和戊酸含量较低(图3)。

2.5 大熊猫血清中SCFAs含量

血清样本中检测到的主要SCFAs包括甲酸、乙酸、丙酸和正庚酸，其平均含量分别为7.32、4.71、3.24和0.74 μg/mL；异戊酸和戊酸含量较低(图4)。其中甲酸含量较高，这可能与生物体肠道内所产生相应的SCFAs以及被吸收利用的比例有关。

3 讨论

3.1 主食竹、粪便和血清中短链脂肪酸的GC/MS分析

SCFAs生理活性较强，是维持生物体肠道健康和体内环境平衡的重要物质，并能发挥多种肠道和系统性效应。生物体内的SCFAs含量受肠道微生物群与饮食之间的复杂相互作用影响[12-14]。近年来，越来越多的研究确定了SCFAs在肠道微生物群、饮食和宿主之间相互作用中的重要作用[15]。由于SCFAs易挥发，从而导致样品定量不准确，重复性差。本文中采用将样品进行PFBBr衍生化后提取，并通过用正己烷萃取实现衍生化产物的最佳提取效率。在上述内容的基础上，建立了对大熊猫主食竹、粪便和血清样本中12种SCFAs检测的GC/MS定量方法，并进行了方法学考证。结果表明12种 SCFAs的标准曲线均具有良好线性，R2均大于0.999，且相对标准偏差(RSD)低，表现出良好的重复性和精密度。

3.2 主食竹不同部位中SCFAs的含量差异及其生理作用

研究表明，在苦竹不同部位中主要的SCFAs含量存在差异。除竹笋中异丁酸、2-甲基丁酸、丁酸、异戊酸的含量较竹叶和竹茎高外，其余的SCFAs都以竹叶中含量最高。竹笋中丁酸可转化为β-羟丁酸而为机体供能，2-甲基丁酸、异戊酸和异丁酸合称为异位酸，异位酸不仅能促进机体肠胃对食物中结构性碳水化合物的降解[16]，还能促进纤维降解菌群的生长，从而有利于纤维物质的消化。除此，2-甲基丁酸可以提高食物的适口性，也有研究表明在雌性泌乳中期食物中添加异丁酸，可使产奶量和体重增加[17]。这表明竹笋对于大熊猫而言不仅适口性好，营养价值高利于消化，且在雌性泌乳抚育幼仔期，采食竹笋有利于产奶以及补充体能。

竹叶中乙酸、甲酸、正己酸和丙酸含量较高，从苦竹中检测出的主要SCFAs含量与在生物体内起主要生理作用SCFAs的生成顺序乙酸>丙酸>丁酸相似[18]。乙酸到达门静脉循环，随血液进入全身循环作为周边组织的能源。丙酸作为糖异生前体物质产生的葡萄糖能满足动物30%—50%的能量需求，乙酸、丙酸和丁酸被肠黏膜上皮细胞吸收后均能作为其重要的能量来源[19]。Tong 等[20-21]研究表明，丙酸、丁酸等能增加肠上皮细胞密切连接蛋白ZO-1等的表达，减少促炎因子的生成，有利于黏膜炎症的修复以增强肠黏膜的机械屏障功能。寇莎莎等[22]研究发现，食物中添加丁酸钠可以促进动物断奶后的生长以及提高肠道消化酶活性。成年大熊猫因其肠道发育的完整性以及肠道微生物群落的丰富性[23]，竹竿是其常食部分，断奶后的幼体和衰老个体，以竹叶为主食，竹叶中富含的乙酸、丙酸和丁酸，不仅有利于这些肠道发育不足或年老的个体对竹子中纤维素的消化，从而保证肠道功能的完整性，还能减少相关疾病的发生。目前大多研究仅停留在乙酸、丙酸、丁酸3种短链脂肪酸对于机体生理作用的探究，关于样本中含量较高的甲酸以及其他短链脂肪酸在机体中发挥什么作用仍需进一步的探索。

3.3 短链脂肪酸在主食竹、粪便以及血清中相关性分析

粪便与血清中主要以甲酸和乙酸为主，肠道中产生的主要SCFAs在吸收进入血液循环系统前，大量的丙酸、丁酸会被形成肠壁的肠细胞吸收，从而用于生产能量。部分吸收未被消耗的SCFAs，例如乙酸则通过基底外侧膜释放到肝门静脉，并通过肝脏进入血液到达全身循环，外周肌肉组织通过代谢这些未改变的脂肪酸以产生能量[24]，其余未被吸收或逃脱吸收的SCFAs则随粪便排出。因此，粪便与血清中SCFAs的含量与机体肠道内产生的SCFAs密切相关。现有研究表明，生物体肠道内SCFAs的总量与外源添加SCFAs和日粮纤维的含量成正相关性[25]。竹子作为大熊猫的主食，大量的纤维素和木质素又属于不溶性纤维，具有高度的可发酵性，能在生物体肠道中产生更多的SCFAs[26]，其自身富含的SCFAs也能为机体补充相应的SCFAs。粪便以及血清中的SCFAs浓度在一定程度上可反映肠道产生的SCFAs浓度，因此，竹子中的短链脂肪酸与粪便、血清中的短链脂肪酸具有一定的相关性。

4 结论

本文利用GC/MS方法，对于苦竹、大熊猫粪便及血清中的短链脂肪酸进行分析及测定。研究发现苦竹中SCFAs的含量在其不同部位存在差异，这些SCFAs对大熊猫机体产生一定的生理作用，能促进大熊猫肠道对竹子中的纤维素的消化以及营养物质的吸收，维持肠道健康等功能。研究探讨了苦竹、大熊猫粪便及血清中的SCFAs存在的相关性，以上结果能为进一步研究探讨大熊猫食性研究提供了数据支撑。后续需结合大熊猫肠道中产生的SCFAs来进一步验证主食竹、血清以及粪便中SCFAs含量的相关性，以及肠道中SCFAs的生理作用。