阎朝华 胡安东 陈国权 周碧君，3*文 明，3* 王开功，3 赵大杰 张 旭

(1.贵州大学动物科学学院，贵阳，550025；2.贵州大学动物疫病研究所，贵阳，550025；3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵阳，550025)

大肠杆菌(Escherichiacoli)是一种重要人畜共患病的条件性致病菌，根据其寄生场所将其分为肠内致病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichiacoli，EnPEC)和外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)。根据产毒素的不同可将致病性大肠杆菌分为产肠毒素大肠杆菌(entero toxigenicEscherichiacoli，ETEC)、产类志贺毒素大肠杆菌(shigalike toxinEscherichiacoli，SLTEC)、 肠道致病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichiacoli，EPEC)、败血性大肠杆菌(septicEscherichiacoli，SepEC)及尿道致病性大肠杆菌(urethral pathogenicEscherichiacoli，UPEC)，在动物群体中最常见的为产肠毒素大肠杆菌[1-3]。棒状杆菌(Corynebacterium)属于棒状杆菌属，是一类革兰氏阳性类球状或棒状菌，表面无鞭毛，不形成芽孢，多呈丛、栅栏样或单个无规则排列的兼性厌氧菌[4]。感染机体后临床表现以多种组织和器官发生化脓性或干酪样病变为主要特征[5-6]。绿色气球菌(Aerococcusviridans)属链球菌科(Streptococcaceae)气球菌属，1953年由Williams等[7]首次提出并命名。1965年Whittenbury在对一些片球菌(Pediococcus)和绿色气球菌、肠球菌(Enterococcus)的亲缘性对比后发现可以根据表型特征将气球菌(Aerococcus)与片球菌区分，同时将绿球菌(Aerococcusviridans)、虾片球菌(Pediococcushomari)和绿色气球菌统一称为绿色气球菌[8]。绿色气球菌可从空气、水、土壤等自然环境中广泛分离得到[9]。动物和人感染后患心内膜炎、菌血症、败血症、败血型关节炎、尿道感染、脑膜炎、脓毒性关节炎等疾病[7-10]。

2019年冬季贵州某竹鼠养殖场养殖中华竹鼠(Rhizomyssinensis)近20只发病，发病初期表现进食减少，精神萎靡，一周后出现下牙脱落，肛门有黏稠脓性分泌物流出，对养殖企业造成严重经济损失。查阅相关文献并设计竹鼠圆环病毒、竹鼠细小病毒、新型竹鼠源阿卡斑病毒等病毒的特异性引物对其送检病料组织进行PCR快速检测，PCR检测结果为阴性；对送检病料体内病原菌进行分离培养并采用形态学观察、生化试验鉴定和16S rDNA基因序列分析，对其分离菌株进行鉴定并结合动物回归实验结果显示从送检竹鼠内脏组织分离出竹鼠源致病性大肠杆菌、致病性棒状杆菌和致病性绿色气球菌3种病原菌，综上推断该养殖场竹鼠死亡原因是竹鼠混合3种致病性细菌所造成。笔者对混合感染竹鼠源致病性大肠杆菌、致病性棒状杆菌和致病性绿色气球菌的3只竹鼠病变组织进行组织病理学分析，以健康正常内脏组织器官病理切片作为对照，以期为竹鼠源致病性大肠杆菌、致病性棒状杆菌和致病性绿色气球菌混合感染引起的组织病理学相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料来源

贵州某竹鼠养殖场送检3只体重均为1 kg患病竹鼠，1只体重为800 g的健康竹鼠购自贵州康源生态农业有限公司。

1.1.2 主要试剂

苏木精染液(140401)、伊红染液(140401)、乙醇(70%、80%、95%、100%)、二甲苯、通用型组织固定液、石蜡等均由武汉塞维尔生物科技有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 送检病料的剖检

在无菌操作台对送检3只竹鼠进行编号，分别为S1、S2、S3。剖检观察并记录其组织病变特征。

1.2.2 组织病理学观察

取正常健康竹鼠做对照，3只送检竹鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏，通用型组织固定液固定组织样品，样品经过石蜡包埋切片，苏木素—伊红(H.E)染色，对用其病理变化3D全景扫描文件观察并描述(扫描仪型号：3D HISTECH Pannoramic250，made in Hungary)。以1只健康竹鼠内脏组织切片为对照，对3只送检患病竹鼠内脏组织切片进行对比分析，探究竹鼠混合感染3种致病性细菌的病理学变化。

2 实验结果

2.1 剖检结果

正常健康竹鼠体型丰满、毛色光亮(图1-1)，剖检后可以看到心脏血管血液充盈、颜色鲜红、无出血、淤血现象(图1-2)；肝脏颜色鲜红，质地光滑(图1-3)，脾脏无肿胀，边缘光滑，颜色鲜艳(图1-4)；肺脏颜色鲜艳呈白色、无出血，表面光滑整齐(图1-5)；肾脏体型饱满，表面光滑无出血点(图1-6)。患病竹鼠下牙脱落，被毛杂乱无光泽(图1-7)；后发现心包有严重无色透明液体、心脏质地柔软凹陷、可见淤血(图1-8)；肝脏表面光滑分布红色细血丝，有明显出血点(图1-9)；脾脏颜色较为暗沉，表面不粗糙，边缘呈锯齿状(图1-10)；肺脏表面可见深红色斑块(图1-11)；肾脏呈大理石色，表面凹凸不平(图1-12)。

由表3可知，当反应时间达到3 h时酶解基本完全，此时的提取率最高。反应时间过长，可能导致水解蛋白质变性分解，当反应时间达到3 h时最佳。

2.2 组织病理学观察结果

正常健康竹鼠心脏细胞排列紧密，分界清晰，胞质丰富，细胞形态正常，组织结构清晰明了(黑色箭头)，无明显病理变化特征(图2-1)；肝脏组肝索结构清晰，肝细胞着色正常，汇管区细胞分界清晰(黑色箭头，图2-2)；脾脏细胞和脾小结细胞丰富、着色均匀，分界清晰明了(黑色箭头，图2-3)；肺脏肺泡壁厚度均匀且较薄(图2-4)；大量肾小管形状呈圆形，分界清晰，管内充满大量的红细胞(黑色箭头)，肾小球和肾小囊清晰可见其内含有大量血红细胞，形态正常，无扩增或萎缩现象(黄色、红色箭头，图2-5)。

感染竹鼠可见心脏组织心肌细胞排列紧密，分界清晰，大量心肌细胞胞质疏松淡染(黑色箭头)，间质可见少量肥大细胞浸润(红色箭头，图2-6)；肝脏组织肝索结构不清，较多肝细胞淀粉样变，呈嗜酸性均质状(红色箭头)，汇管区周围胆管增生(黄色箭头)，并可见极大量的炎性细胞浸润(绿色箭头，图2-7)。脾脏脾小结数量大量减少，红髓淋巴细胞大量减少，并可见大面积淀粉样变，呈嗜酸性均质状(黑色箭头)，髓窦可见淤血及出血(红色箭头，图2-8)；肺脏肺泡壁明显增厚(红色箭头)，广泛可见肺泡出血，肺泡腔内大量红细胞(黑色箭头，图2-9)；肾脏皮质广泛可见肾小管上皮细胞空泡变性，胞质内可见数量不等的微小空泡(绿色箭头)，大量肾小管扩张，形状不规则，管腔内可见嗜酸性团块(黑色箭头)，少量管腔内可见炎性细胞(黄色箭头)，间质少量结缔组织增生(橙色箭头)，肾小球内可见炎性细胞浸润(紫色箭头)，少量肾小球萎缩，肾小囊内充满嗜酸性蛋白液(蓝色箭头)，髓质大量集合管扩张，并可见出血，管腔内大量红细胞(红色箭头，图2-10)。

3 讨论

大肠杆菌是广泛存在于动物体内的一种条件性致病菌[11]，屈孝初等[12]在2000年对大肠杆菌感染引起的竹鼠水肿病进行了首次报道。芦静等[13]报道致病性大肠杆菌可引起长白山杂交猪内脏充血水肿、心包积液、肾脏伴有针尖大小出血点等病变。其病变组织肝脏肝小叶内由淋巴细胞浸润形成巨核细胞 、肝细胞出现萎缩变性，肾脏内大量炎性细胞浸润等组织病理学变化。吕中锋[14]报道的大肠杆菌可引起仔猪肠道和胃壁充血并伴有轻微出血、皮下出血，能引起母猪充血性、患急性和化脓性乳腺炎，在对其病变组织进行病理学观察时发现中性粒细胞浸润、减少和淀粉样蛋白纤维沉淀等。曾喻兵等[15]剖检感染大肠杆菌的竹鼠发现肺脏有点状出血，肝脏肿胀有坏死灶，淋巴结肿胀等病理特征。其对病变组织进行病理学观察可见肝索排列紊乱、大量肝细胞广泛性空泡变性且变性细胞胞浆淡染、门管区周围肝细胞呈片状坏死，胞核固缩等组织病理学变化。潘淑惠等[16]发现山羊感染伪结核棒状杆菌感染组织出现不同程度的肿胀，对病变组织进行病理学观察发现皮下组织形成肉芽，有炎性细胞浸润、肺脏细胞水肿及细胞增生、多脏器淋巴细胞浸润等病理变化。王振忠等[17]发现鸭源棒状杆菌病例可见腹水，腹部皮下及肠壁肠系膜布满黄白色豆粒状大小结，肝脏肿大且出现坏死灶，肝窦扩张，肝细胞淤血，肾小管上皮细胞脱落，脾脏细胞大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润等病理学变化。张乃嘉等[18]分离的猪源绿色气球菌可知感染病例心包有明显积液、心肌出血，肺脏出血，脾脏边缘出血性梗死，肝脏有出血点，肾脏肿大呈苍白色，全身淋巴结肿大、出血等症状。李楠等[19]报道绿色气球菌可造成山羊的真胃、肝脏等内脏器官出血，本实验心脏淤血、心包充满积液，肝脏出血、肿大，脾脏肿胀，肾脏苍白色等病变特征与上述文献报道基本吻合，综上所述，细菌感染动物不具有特异性，并且同一种细菌感染引起的组织病变也不尽相同。

本实验对混合感染致病性大肠杆菌、致病性棒状杆菌和致病性绿色气球菌的竹鼠内脏组织进行组织病理学观察，发现送检竹鼠心脏组织均有心肌细胞，胞质疏松淡染、肥大细胞浸润等病理学变化特征，个别送检竹鼠心脏组织心肌细胞出现心肌细胞减少被纤维结缔组织取代的病理学变化；肺脏组织肺泡壁厚度不一(表现为肺泡壁变薄或增厚)，广泛可见肺泡出血并充满大量红细胞等相同变化，同时个别竹鼠肺脏组织肺泡扩张或萎缩，局部可见巨噬细胞和炎性细胞浸润等不同的病理学变化；肝脏组织肝索结构不清，肝细胞出现淀粉样变，呈嗜酸性均质状，汇管区周围胆管增生并伴随炎性细胞浸润(图2-7，绿色箭头)；脾脏脾小结数量，红髓淋巴细胞少和淀粉样变，呈嗜酸性均质状；肾脏肾小球内均可见炎性细胞浸润、肾小管上皮细胞空泡或肿胀，肾脏细胞可见嗜酸性团块等相同变化，其余肾脏细胞出现肾小管扩张、髓质集合管扩张等不同的变化。目前致病性大肠杆菌、致病性棒状杆菌和致病性绿色气球菌对竹鼠的致病机理还不清楚，但本研究在排除竹鼠常见病毒病的前提条件下对3例混合感染3种致病性细菌的竹鼠内脏组织进行组织病理变化分析发现，3例混合感染致病性细菌的竹鼠肝脏心包积液、肝脏出血肿大、脾脏肿大、肾脏肿大等相同点，但有点心脏心包和淤血积液程度、个别心脏伴有点状出血点，肾脏有点表现为肿胀、表面有出血点，但有点在肿胀的同时也伴随坏死灶等，因此本次送检样品的病变特征具有一定差异，综合分析认为引起内脏组织发生不同的病理变化原因可能与混合感染和感染竹鼠内脏组织的细菌浓度等因素有关。大肠杆菌是一普遍存在于人和动物的消化道、呼吸道、泌尿系统内一种条件致病菌[20]。棒状杆菌是一种条件致病菌，人类医学相关研究表明棒状杆菌是人类皮肤常见菌群之一，感染人、猪、家禽等也偶有报道[21-23]。相关学者也有猪源、人源、鸭源、罗非鱼源等绿色气球菌的报道[21-25]，但还未有大肠杆菌、棒状杆菌和绿色气球菌混合感染竹鼠和相关病理学变化研究的报道，相关混合感染后引起临床特征和病理变化尚不明确。因此还需进一步探究才能了解大肠杆菌、棒状杆菌和绿色气球菌混合感染的致病机理。

4 结论

本研究对混合感染致病性大肠杆菌、致病性棒状杆菌和致病性绿色气球菌的竹鼠病例组织进行了组织病理学观察和分析，以期为竹鼠细菌病的研究提供病理学参考资料。