王伊琴 陈少博 杨 帆 包勇敢 荆文魁 常 鸿 康晓平

(1.二连海关技术中心，二连浩特，011100；2.呼和浩特海关，呼和浩特，010010；3.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，北京，010071)

野生动物是大自然的产物，世界各国对珍贵、濒危的野生动物实行重点保护。黄羊(Procapragutturosa)是我国Ⅱ级保护野生动物，中国濒危动物红皮书濒危物种，主要分布于蒙古国的东部草原，中国的呼伦贝尔盟、锡林郭勒盟、乌兰察布盟，并集中分布在两国的边境地带。栖息于半干旱的草原，草食性，性喜群栖，集群的时间比较长，移动的距离和范围也大，一般在春季和秋季进行大规模迁移，同时黄羊也受国际公约保护迁徙野生动物保护公约的保护[1]。20世纪70年代，内蒙古草原有野生黄羊300多万头，八九十年代，内蒙古还有野生黄羊100万头左右。最近20年来，由于盗猎分子的疯狂猎杀，目前估计整个内蒙古只有几千只[2-3]。每年冬季蒙古国大量黄羊越境到中国过冬，过冬之后又返回蒙古国，据统计仅2015年12月9日，有近600只黄羊通过二连浩特进入中国境内，为保护好这批野生黄羊，有关部门日夜坚守，密切关注野生黄羊群动向，确保野生黄羊在中国境内的安全。但是，在蒙古国和中国部分地区存在以猎捕野生黄羊为乐、以猎捕野生黄羊贩卖谋取利益，使野生黄羊资源遭到严重的破坏[4-5]。又因为蒙古国是口蹄疫、小反刍兽疫的疫区，由于黄羊肉可食用，黄羊角可入药，通过黄羊携带疫病、疫情传入我国的风险日益增加，时刻威胁我国公共卫生安全。这就要求我们加强保护野生动物标准体系的建设，在进出口动物及其制品中准确甄别动物源性，确保世界迁徙野生动物受到保护，维护公共生物安全体系，从源头上打击走私贩卖行为，黄羊源性成分的快速、灵敏、准确的检测技术研究，为保护我国濒危野生动物资源，为海关缉私执法提供了强有力的技术保障。

目前，黄羊源性成分的检测技术的研究尚未见有相关的报道，本研究通过对黄羊的组织分别进行PCR和Real-time PCR检测，分别进行了特异性、灵敏性和稳定性试验，结果表明2种技术均能满足日常的动物源性成分的检测要求，为保证准确甄别源性成分提供了强有力的技术保证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

基因组DNA提取试剂盒购于Bio Dev-Tech公司，DNA凝胶回收试剂盒及pGEM-T Easy载体购于Promega公司；Taqplus DNA聚合酶、限制性内切酶EcoR I 及DNA Marker 为TaKaRa 公司产品；大肠杆菌感受态细胞购于Trans Gene Biotech公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 样品

本试验是在无菌条件下采取了6份健康黄羊的皮毛、肉等组织样品。

1.2 方法

1.2.1 引物

根据GenBank中已发表序列(DQ266332.1)，应用Primer Premier 5.0设计特异性引物，针对黄羊线粒体基因设计引物序列如下：

由上海生工合成。

上游引物：5′-CTAGGCAACATGCATATC-3′；

下游引物：5′-CGAGAAGAGAAATCCTTG-3′。

探针：5′-FAM-CACGAGCTTAATGACCATGCCG-TA MRA-3′。

1.2.2 阳性质粒的制备和酶切鉴定

利用本试验所设计的引物，黄羊DNA进行PCR扩增，将PCR产物利用胶回收试剂盒进行回收和纯化，纯化后PCR扩增产物与pGEM-T easy vector进行连接，4℃水浴过夜。将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素，X-gal和IPTG的LB琼脂平板，于37℃温箱中倒置培养20 h，随机挑取白色菌落进行筛选。挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB 培养液中，37℃振荡培养过夜。利用质粒提取试剂盒制备质粒，然后对其进行酶切和PCR鉴定，同时并送至上海生工公司进行测序分析。

1.2.3 普通PCR的扩增

该引物扩增了94 bp核苷酸。基因组总DNA的提取按试剂盒方法进行。PCR反应在25 μL体系中进行，其中含有：基因组DNA 200 ng，引物0.5 μM，dNTP 200 μM，Taqplus DNA Polymerase(5 U/μL)0.5 μL，0.1M10×Ammonium Buffer，ddH2O 17 μL，进行PCR扩增，循环条件如下。

94℃预变性5 min，94℃变性30 s，61℃退火40 s，72℃延伸40 s，共循环36次，最后于72℃延伸8 min。

1.2.4 Real-time PCR反应

PCR扩增体系25 μL：Premix ExTaqTM12.5 μL，上下游引物、探针(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 7.5 μL。

扩增条件：94℃预变性10 min，94℃变性15 s，58℃退火，延伸1 min，40个循环，58℃收集荧光。

1.3 PCR和Real-time PCR的特异性试验

以同种方法提取等量的黄羊、牛(Bos)、羊(Caprinae)、马(Equuscaballus)、猪(Sus)、鼠(Rattus)、鸡(chicken)DNA和水(空白对照)为模版，分别进行PCR和Real-time PCR检测，检测其特异性。

1.4 PCR和Real-time PCR的灵敏性试验

黄羊阳性质粒浓度(97.3 μg/mL)为模板，对该阳性质粒进行 10 倍系列稀释，取6个梯度的DNA浓度，分别进行PCR及Real-time PCR扩增，检测反应的灵敏性，并以其对应的拷贝数的对数与Ct值做标准曲线，评价其灵敏性。

1.5 Real-time PCR稳定性试验

黄羊阳性质粒浓度(97.3 μg/mL)为模板，做10倍系列稀释，取10-1—10-5倍比稀释的5个梯度的DNA模板进行重复性试验，每次试验设3次重复，共进行3次试验，计算组内和组间Ct值的变异系数。

2 结果

2.1 样品的DNA浓度及纯度

所提取样品的DNA 浓度在20.8—244 ng/μL范围内，A260/280在1.8—2.0间，完全可满足PCR和Real-time PCR 检测的要求。

2.2 普通PCR扩增、克隆和酶切鉴定

PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，条带大小与扩增片段基本一致约为94 bp(图1)，初步证实为黄羊的目的基因。PCR 产物纯化后克隆到载体中，转化后挑取阳性菌落，经EcoR I 酶切可获得3 000 bp和94 bp左右2个条带，(pGEM-T Easy 载体两端分别存在1个EcoRⅠ酶切位点)，这与载体和插入目的的片段大小正好相符(图略)。同时应用上、下游引物在重组质粒中PCR 扩增出大小约为94 bp 的条带，结果表明扩增片段已经插入载体中(图1)。

2.3 普通PCR的特异性试验

分别对黄羊、马、牛、羊、猪、鼠、鸡的DNA以及水(空白对照)进行扩增，以检测方法的特异性。

2.4 普通PCR的灵敏性试验

黄羊质粒DNA的浓度为97.3 ng/μL 。用ddH2O依次10倍稀释7个梯度，即每个反应模板浓度分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL，以确定方法对单一模板的灵敏度，该方法的灵敏度为0.1 ng/μL。

2.5 Real-time PCR的特异性试验

用黄羊引物探针体系分别对黄羊、马、牛、羊、猪、鼠、鸡、水的DNA 进行扩增，由图4可见，黄羊的DNA在Ct值为12.39时出现扩增曲线，其他动物组织和空白对照则没有扩增曲线。

2.6 Real-time PCR的灵敏性试验

图5中曲线从左向右加入模板DNA浓度依次是100、10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1 ng/μL，对应的Ct值分别为13.24、17.77、20.07、24.56、28.06、31.65、36.12。Ct值<35的最大稀释度溶液中的模板DNA含量为0.001 ng/μL，即为黄羊源性成分检测的灵敏度。

以x轴代表质粒拷贝数的对数，y轴代表Ct值，绘制标准曲线图6。

根据图6标准曲线可知，当质粒浓度从100 ng/μL—10-4ng/μL 时，随质粒稀释度的增加，对应的Ct值也逐渐增大，且具有一定的线性关系。y=-3.7282 log 拷贝数+39.409，相关系数R2=0.996 6，说明在模板浓度范围内都具有很好的线性关系，可以用于样品的定量分析。

2.7 Real-time PCR的组内、组间稳定性试验

2.7.1 组内稳定性试验

如表1所示，模板DNA浓度10—0.001 ng/μL的5个倍比稀释度内，每一稀释度内做3个重复，Real-time PCR扩增反应的Ct值的标准差从0.06—0.60，变异系数0.314%—1.797%，图7的扩增结果曲线也表明所建立的方法具有较好的组内稳定性。

表1 不同DNA浓度下组内、组间重复性试验结果Tab.1 The results of intra and inter group repeatability tests at different DNA concentrations

2.7.2 组间稳定性试验

如表1所示，模板DNA浓度10—0.001 ng/μL的5个倍比稀释度内，每个稀释度做一次试验，共做3次试验，Real-time PCR扩增反应的Ct值的标准差从0.15—3.32，变异系数0.671%—7.144%，图8的扩增结果曲线也表明所建立的方法具有一定的组间稳定性。

3 讨论

2013年欧洲爆发的马肉风波，美国“沃尔玛狐狸肉造假”事件，揭露了肉制品的掺假现象的严重性，引发了全球公众对肉制品安全的担忧[6]。我国食品风险监测已将肉制品的动物源性成分鉴定(牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分检测)纳入到常规监测中[7]。濒危野生动物物种DNA鉴定技术是打击肉制品掺假、走私，维护市场秩序，保护野生动物资源，提供了强有力的技术保障。

3.1 基于DNA 特异性序列分析方法建立的核心内容是选择物种特异性DNA 靶序列。由于动物细胞存在2套基因组DNA，分别是线粒体基因组DNA 和核基因组DNA，因此，特异性DNA 靶序列选择时存在2种可能，一种源于线粒体基因组DNA，另外一种源于核基因组DNA。目前，报道和应用的动物源性成分检测方法大部分是针对线粒体基因组DNA 靶序列的，如12S RNA，16S RNA，18S RNA，Cybt序列等。此外越来越多的研究开始筛选核基因组DNA 特异性靶序列，如MC1R、LF、TRF、IL-2、β-actin、cGMP、BGH、cGMP、PDEs、RyR、MY等，并将其用于动物源性成分检测[8]。

3.2 黄羊属于洞角科(Bovidae)，其物种进化的同源性表明与牛的同源性大于98%，高于羊的同源性95%[9]，本研究PCR和Real-time PCR方法，对检测的特异性分析结果，与牛、羊等未见有交叉扩增，均有很好的特异性。

3.3 本研究中的灵敏性特点分析，普通PCR法灵敏度分析，模板DNA灵敏度为0.1 ng/μL，较之孙艳华等[10]建立的普通 PCR 检测熟肉肉类来源的方法检测限为5%，本研究更具灵敏性，同时，普通 PCR 存在耗时长、产物易污染等不足[11]。

Real-time PCR方法灵敏度分析，模板DNA灵敏度0.001 ng/μL，较之Jonker 等[12]建立的检测体系 50 pg/μL 更为灵敏，灵敏度线性相关系数R2=0.996 6，可以定量研究Ct值与拷贝数的关系。较之Wang等[13]建立的应用牦牛肉的方法体系0.001%相一致，与Fang等和Druml等[14-15]建立的方法体系，检出限1 pg相同。总之，本研究所设计的黄羊引物、探针体系以线粒体细胞色素b基因为目的基因，Real-time PCR方法特异性、灵敏性、稳定性均优于普通PCR方法，而且可以量化分析，是探索动物源性成分检测方法的优势方法，其缺点是仪器设备要求高、价格高，对于基层检测单位不利于满足设备要求[16]。

3.4 组内、组间稳定性试验研究分析，组内稳定性试验研究中，模板DNA 0.001 ng/μL时，平均Ct值33.23，变异系数CV%为0.018，较模板浓度10—0.01 ng/μL的平均CV%0.004 3高了近1个数量级。组间稳定性试验研究中，模板DNA 0.001 ng/μL时，Ct值32.49，变异系数CV%为0.071，较模板浓度10—0.01 ng/μL的平均CV%0.018高5倍。因此，根据稳定性的研究，组内CV%、组间CV%均小于25%，符合联合国粮农组织(FAO)统一的检测数据评价标准。并组内试验的稳定性好于组间试验。模板DNA稀释度越高，Ct接近阈值35时，组内、组间稳定性试验Ct值的SD越高，CV%大，试验的稳定性也越差。

3.5 研究成果标准化后，应用推广将对保障我国国境口岸野生动物物种鉴定发挥重要的作用，为保护濒危野生动物资源，为海关缉私执法提供了强有力的技术保障。