张 帅，谭菲菲，王 妍，宋欢欢，李向东，王同燕，田克恭

（1.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450000；2.国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳 471003）

兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）属于杯状病毒科兔病毒属，是一种能够引起兔出血性疾病（rabbit hemorrhagic disease，RHD）的单链RNA病毒[1]。该病毒粒子含有7.9 kb的基因组（genomic RNA，gRNA）及2.2 kb亚基因组(subgenomic RNA，sgRNA)，具有两个相互交叉的开放阅读框（open reading frames，ORFs），其中ORF1编码的多聚蛋白，被切割成主要的结构衣壳蛋白VP60以及解旋酶、RNA依赖性RNA聚合酶、蛋白酶等非结构蛋白；ORF2编码一种小型结构蛋白VP10。在病毒颗粒中也发现了同时编码结构蛋白VP60和VP10的亚基因组mRNA[2]。该病毒最早于1984年在中国被首次报道[3]，随后在世界各地流行，目前在多个国家流行[4-7]。该病毒具有两个血清型，所有致病株病毒属于同一血清型，包含RHDV和RHDVa两个亚型，对兔子具有较高的致死率[8-10]。

由于RHDV缺乏合适的细胞培养系统，目前RHDV的防控主要依靠组织灭活疫苗，虽然能够为现行流行毒株提供免疫保护，但是存在外源感染、成本难控、动物福利等问题，因此，开发一种安全、廉价、有效的亚单位疫苗对RHDV的防控具有十分重要的意义。VP60蛋白形成的病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）能够与成人“O”型红细胞表面的糖脂配体结合发生凝集（hemagglutinin，HA）反应[11]，免疫兔子后具有较好的免疫原性与反应原性[9,12]，是RHDV诊断和疫苗设计的主要抗原蛋白[13]。杆状病毒表达系统（baculovirus expression system，BVES）生产的重组VP60蛋白具有良好的生物活性，但由于VP60蛋白糖基化水平较高，而昆虫细胞糖基化修饰效率较低，导致BVES生产重组VP60蛋白产量不高，难以满足实际应用的需要。

为提高VP60蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达量，本研究在供体质粒水平上利用杆状病毒基因组中的同源重复增强子（homologous region enhancer，Hr）Hr1、Hr3、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element，WPRE）、哺乳动物早期启动子SV40以及由巨细胞病毒（the cytomegalovirus，CMV）早期增强子（early enhancer element）和鸡β-肌动蛋白（chicken beta-actin）形成的组合型启动子CAG等顺式作用元件及元件组合对pFastBacDual供体质粒进行改造；在目的基因水平通过添加蜂毒素信号肽（honeybee melittin signal peptide，Melt）序列对VP60基因进行优化；旨在获得对重组VP60蛋白具有优化作用的改造类型，为RHDV基因工程亚单位疫苗的低成本开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株与细胞pFastBacDual质粒、pCAGGS质粒、DH10Bac感受态细胞、sf9细胞由国家兽用药品工程技术研究中心保存。

1.2 主要试剂Prime STAR® HS DNA Polymerase、BacPAK™ Baculovirus Rapid Titer Kit 购自宝日医生物；质粒提取试剂盒、2×TaqPCR预混试剂Ⅱ购自天根生化科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自美国OMEGA Bio-Tek试剂公司；PageRuler™Prestained Protein ladder、HRP标记羊抗兔IgG、羊抗鼠绿色荧光二抗购自赛默飞世尔科技有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Kit试剂盒购自全式金生物技术有限公司；Cellfectin® II Reagent购自gibco公司；Insect-XPRESS无蛋白昆虫细胞培养基购自lonza公司；NC膜购自生工生物工程（上海）股份有限公司；DAB Kit购自康为世纪生物科技有限公司；细胞瓶、细胞板购自康宁公司；RHDV多抗血清、RHDV VP60鼠源单克隆抗体为国家兽用药品工程技术研究中心制备保存；基因、引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 1%人O型红细胞配制采集状况良好人“O”型全血与等体积阿氏液混合，4℃保存过夜后使用。用pH 7.0、0.015 mol/L PBS洗涤，200×g离心5 min至红细胞上清无溶血，用PBS配制成体积比为1%红细胞悬液，4℃保存备用。

1.4 目的基因的扩增根据中RHDV毒株RED1-2013（GenBank登录号：KY679903.1）的VP60氨基酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司优化合成昆虫细胞密码子偏好的基因序列[14]。以合成基因为模板，用相应的引物对（表1）扩增获得BamHIMelt-VP60-EcoRI、BamHI-VP60-EcoRI、SmaIMelt-VP60-PaeI、SmaI-VP60-PaeI基因片段，按照pEASY-Blunt Simple Cloning Kit说明书进行基因克隆，挑选鉴定正确的克隆送测序。杆状病毒基因组（GenBank登录号：NC_001623.1）中同源增强子Hr1、Hr3；WPRE转录后调控元件（GenBank登录号：HW158052.1）；SV40早期启动子（参照pACGFP-C1质粒序列）由苏州金唯智生物科技有限公司合成；CAG组合启动子以pCAGGS质粒为模板PCR扩增得到，按照pEASY-Blunt Simple Cloning Kit说明书进行基因克隆，挑选鉴定正确的克隆送测序。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 pFastBacDual供体质粒的改造通过人工基因合成、分子克隆等手段将Hr1、Hr3、SV40、CAG、WPRE等顺式作用元件及元件组合整合到pFastBacDual供体质粒，获得了11种改造供体质粒。将优化后扩增的VP60基因、Melt-VP60基因片段插入到pFastBacDual及改造后的供体质粒中，共获得15种含有VP60基因的供体质粒（图1），酶切鉴定正确后送金唯智测序。

1.6 重组Bacmid的鉴定与抽提将100～300 ng测序正确的供体质粒转化到DH10Bac感受态细胞，通过3种抗性（卡那霉素、庆大霉素、四环素）筛选及蓝白斑筛选，挑选白色单克隆菌落，使用BacM13F、BacM13R进行菌落PCR鉴定，筛选阳性单克隆菌落，使用卡那霉素、庆大霉素、四环素抗性液体LB培养基进行扩大培养。使用天根质粒抽提试剂盒中的P1、P2、P3抽提重组Bacmid，分光光度计测定Bacmid浓度及纯度。

1.7 重组杆状病毒的拯救与鉴定选择D260/280值在1.8～2.0，浓度不低于500 ng/μL的重组Bacmid，按照Cellfectin II Reagent转染试剂的说明书转染sf9细胞，转染后每24 h观察1次细胞状态，与正常sf9细胞对比，直至出现细胞核增大、细胞停止生长、胞内出现小泡，收集上清液，命名为Ac-改造类型-RHDV-VP60，标记为P1代。按照体积比1∶100在25T细胞瓶中盲传2代，P3代按照1∶100体积比在摇瓶中进行悬浮培养获得P4代病毒。P3、P4代重组杆状病毒表达的重组VP60蛋白使用1%人“O”型红细胞测定HA活性。

1.8 重组杆状病毒滴度测定96孔细胞板接种6.5×104个/孔sf9细胞制备单层细胞。将P4代重组杆状病毒梯度稀释后，每孔接种稀释后病毒液25 μL，27℃恒温培养箱吸附1 h后，吸弃病毒液加入50 μL甲基纤维素，27℃湿盒内培养43～47 h。4%多聚甲醛进行固定后，使用GP64鼠源单克隆抗体作为一抗，羊抗鼠HRP作为二抗，通过过氧化物底物显色，在光学显微镜下观察最高稀释度孔内蓝斑数量，数量在5～25时较为合理，如果不在此范围内，观察其余稀释度孔内蓝斑数量。滴度计算公式：病毒滴度（IFU/mL）=平均蓝斑数量×稀释度的倒数×40。

图1 VP60基因在pFastBacDual供体质粒的构建示意图Fig.1 Schematic diagram of VP60 gene insertion pFastBacDual donor plasmid

1.9 间接免疫荧光（indirect immunofluorescrence assay，IFA）检测重组蛋白24孔细胞板按照2.5×105个/孔接种Sf9细胞，P4代重组杆状病毒按照MOI=2接毒，27℃恒温培养箱培养72 h，使用RHDV VP60鼠源单抗隆抗体1∶500倍稀释作为一抗，羊抗鼠IgG绿色荧光抗体1∶500倍稀释作为二抗，荧光显微镜下观察荧光，判定重组VP60蛋白的反应原性。

1.10 SDS-PAGE鉴定重组VP60蛋白P4代rAc-RHDV-VP60按照MOI=2在摇瓶中传代P5代，接毒96 h后收获重组杆状病毒，4℃条件下，100×g离心10 min，取等量上清液培养物用于SDS-PAGE电泳鉴定重组VP60蛋白表达情况。

1.11 Western blot鉴定重组VP60蛋白重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转至NC膜上，使用5%脱脂牛奶封闭1 h后，RHDV多抗血清按照1∶1000使用5%脱脂牛奶稀释作为一抗孵育1 h，PBST洗脱（5 min/次），HRP标记羊抗兔IgG 1∶5000作为二抗孵育1 h，PBST洗脱3次（5 min/次）后，使用康为世纪DAB显色试剂盒避光显色1 min，ddH2O清洗NC膜终止显色后封闭保存，观察显色状况预判重组VP60蛋白与单克隆抗体反应情况。

1.12 HA试验在96孔V型微量反应板中加入25 μL/孔0.015 mol/L的PBS（pH7.0），吸取25 μL上清液培养物加入第1孔，混匀；从第1孔吸取25 μL混合液加入第2孔混匀，依次倍比稀释，最后1孔弃去25 μL混合液，留作空白对照，悬空加入25 μL/孔的1%人“O”型红细胞悬液，轻轻震荡均匀，室温静置45 min后观察结果。在空白对照成立的条件下，以50%出现凝集的最高稀释倍数为HA效价。测定HA效价，通过log2△HA效价来反应不同改造类型对重组VP60蛋白表达量的影响。△log2HA=log2试验组HA-log2对照组HA。

2 结果

2.1 重组杆状病毒滴度测定结果P4代重组杆状病毒滴度结果显示：rAc-Hr3-RHDV-VP60、rAc-Hr3-WPRE-Melt-RHDV-VP60、rAc-SV40-WPREMelt-RHDV-VP60试验组病毒滴度高于rAc-PFBDRHDV-VP60对照组，表明Hr3、Hr3-WPRE-Melt、SV40-WPRE-Melt对重组杆状病毒滴度提升具有促进作用；rAc-WPRE-RHDV-VP60、rAc-CAGRHDV-VP60、rAc-Hr3-Hr1-RHDV-VP60试验组病毒滴度低于对照组，表明WPRE、CAG 以及Hr3-Hr1组合不利于重组杆状病毒增殖；其他试验组病毒滴度与对照组差异不显著（表2）。

表2 15种改造的重组杆状病毒滴度测定结果Table 2 Titer measurement results of 15 modified recombinant baculovirus strains

2.2 IFA鉴定重组VP60蛋白IFA鉴定结果（图2） 可知，试验组产生明显高于野毒对照和细胞对照的特异性荧光，表明获得的所有重组杆状病毒均能够表达重组VP60蛋白；表达的重组VP60蛋白能够与VP60单克隆抗体反应，具有良好的反应原性；顺式作用元件及信号肽的插入不影响重组VP60蛋白的反应原性。

2.3 SDS-PAGE与Western blot鉴定重组VP60蛋白不同构建方式获得的重组杆状病毒在55 kDa～72 kDa处均有条带（图3A），大小与预期蛋白大小（60 kDa）一致，表明不同优化方式获得的重组杆状病毒均能够表达VP60蛋白，与IFA鉴定结果一致；Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE、SV40-WPRE-Melt试验组蛋白条带强于Ac-PFBD-RHDV-VP60对照组，表明以上改造方式对重组VP60蛋白表达具有促进作用；WPRE、CAG、Hr3-WPRE-Melt、SV40-Hr3-Melt试验组蛋白条带与对照组相比较弱，表明以上改造方式对重组VP60蛋白的表达无增强作用。Western blot鉴定结果可知（图3B），所有改造类型获得的重组VP60蛋白均能够与RHDV的多克隆抗体血清反应，表明重组VP60蛋白在昆虫细胞内获得了正确表达，具有良好反应原性；与对照组相比，Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE改造类型蛋白产量相对较高；SV40-Hr3-Melt改造类型免疫印迹条带不明显，这可能与该类型获得重组VP60蛋白产量较低有关。

2.4 HA试验鉴定重组RHDVVP60蛋白 所有构建类型获得重组VP60蛋白均能够与人“O”型红细胞发生HA反应，具有良好的反应原性；试验组与rAc-PFBD-RHDV-VP60对照组相比，重组VP60蛋白的HA效价变化见表3。Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE、SV40-WPREMelt改造类型对重组VP60蛋白的表达具有提高作用，其中Hr3、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40、SV40-WPRE改造类型能够提高重组VP60蛋白HA效价8～16倍；WPRE、CAG、SV40-Hr3-Melt改造类型降低了重组VP60蛋白的HA效价；CAG-WPRE、Hr1-Hr3、SV40-Hr3改造类型对VP60的HA效价无影响。Melt信号肽不利于重组VP60蛋白的表达量的提升；单一的CAG、WPRE元件对重组VP60蛋白表达无提升作用，WPRE与Hr1、Hr3、SV40元件组合使用对重组VP60蛋白的表达具有叠加增强作用，但Hr3-Hr1、SV40-Hr3元件叠加使用不利于重组VP60蛋白的表达（表3）。

图2 重组VP60蛋白的IFA分析Fig.2 IFA analysis of recombinant VP60 protein

3 讨论

RHD是一种能够专一感染兔子，引起兔子急性肝坏死、多器官出血等症状的烈性传染病，具有极高的死亡率，给兔肉及皮毛产业造成了重大经济损失，严重危害世界家兔养殖[15-17]。由于RHDV无法进行细胞培养，目前RHDV防控主要依赖于兔肝组织灭活疫苗，但因为组织灭活疫苗存在灭活不完全、外源感染等生物安全风险且生产成本较高、不符合动物伦理要求，所以开发安全高效的新型疫苗对RHDV防控具有十分重要的意义。VP60蛋白是RHDV的衣壳蛋白，在体外能够自行组装成VLP，是RHDV新型疫苗、诊断试剂开发的重要抗原蛋白。研究者尝试过大肠杆菌表达系统[18]、杆状病毒表达系统[19]、转基因植物[20-21]、腺病毒载体[22-23]、毕赤酵母表达系统[24-25]等多种方式表达重组VP60蛋白，这几种生产重组VP60蛋白的方式中，杆状病毒表达系统具有外源基因容量大、翻译后修饰、生物安全性好、体外培养简单等特点，被广泛地应用于不同物种来源的重组蛋白生产[14,26-29]。BVES表达的重组VP60蛋白，免疫机体后，能够产生细胞免疫和高水平的体液免疫[30]。BVES是生产重组VP60蛋白的理想方式，但BVES生产的重组VP60蛋白产量相对不高，不能满足实际生产的需要。

图3 SDS-PAGE和Western blot鉴定重组RHDV VP60蛋白Fig.3 SDS-PAGE and Western blot identification of recombinant RHDV VP60 protein

表3 不同构建方式拯救的rAc-RHDV-VP60的△log2HA效价Table 3 △log2HA titer statistics of rAc-RHDV-VP60 rescued by different construction methods

根据Hr1、Hr3增强子、CAG强启动子能够增强目的基因转录，WPRE能够转录后调控mRNA，SV40启动子能够在感染早期阶段表达目的基因，Melt信号肽能够引导目的蛋白进行分泌表达等特性，本研究选择应用以上元件及元件组合改造供体质粒，在载体水平优化以提升重组VP60蛋白在BVES中的表达量，旨在降低重组VP60蛋白生产成本。研究结果表明：使用Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE、SV40-WPREMelt改造类型的供体质粒均能够提高重组VP60蛋白产量，提升效果最为显著的是Hr3、SV40-WPRE改造类型的供体质粒，表达的重组VP60蛋白均具有良好的反应原性，关于表达的重组VP60蛋白免疫原性及蛋白稳定性，有待进一步研究。

与Lop é z-Vidal等[31]将Hr1与Ac-ie-01调控元件组成的TB表达盒提升重组VP60蛋白表达量相比，本研究Hr1的提升作用与TB表达盒相当，而Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE提升效果高于TB表达盒，这可能与Hr3、SV40转录效率高于Hr1，WPRE翻译后调控效率高于Ac-ie-01有关，还与启动子、增强子与WPRE翻译后调控元件组合后，目的蛋白转录翻译效率叠加增强相关。与Yang等[32]报道的在猪瘟病毒E2蛋白基因前添加Melt信号肽序列能够显著提高E2蛋白的分泌表达相比，添加Melt对重组VP60蛋白分泌表达无提升作用。这可能与重组VP60蛋白直接组装成VLPs以分泌蛋白形式表达，无需信号肽诱导有关，添加信号肽序列反而增加了蛋白后期修饰工作，影响蛋白表达产量。与Shang等[33]报道的在pFastBac供体质粒中将SV40 polyA替换为Polh polyA能够提高重组蛋白产量相比，本研究中将Polh启动子替换为SV40启动子后对重组VP60蛋白产量提升效果更为显著，这可能与SV40启动子替换Polh启动子后，pFastBacDual中间转移载体的SV40 polyA提高了mRNA稳定性与翻译效率有关。

本研究通过改造pFastBacDual供体质粒，优化重组VP60蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达，得到的重组VP60蛋白具有表达产量高、反应原性好等特点，为更低成本生产RHDV亚单位疫苗和诊断试剂的开发提供参考，同时对其他亚单位疫苗在BVES的优化表达具有一定的借鉴意义。