屈孟锦，李雪松，滕巧泱，李鲁兆，刘性坡，崔宏锐，杨健美，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

H9N2亚型禽流感（avian influenza，AI）在世界范围内广泛存在，给养禽业发展和人类健康带来严重危害[1]。自1994年首次报道在我国鸡群中分离到H9N2禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）[2]以来，该病毒在我国已流行20多年，几乎所有的养殖场都有该亚型AIV的存在。H9N2 AIV也可以感染哺乳动物，包括猪和人类，自1999年首次从人体中分离到H9N2流感病毒后，随后又在广东、云南等地从人体分离到了该病毒[3-6]。H9N2 AIV还会与其他亚型流感病毒发生重组，如近些年引起社会恐慌的H7N9禽流感病毒，其内部基因就是由H9N2禽流感病毒提供的[7]。由此可见，H9N2 AIV造成的危害不容忽视。

AIV由8个基因组成，其中血凝素（hemagglutinin，HA）是AIV的主要抗原，变异频率很高[8]，其变异会导致AIV抗原变异。Li等[9]发现1996-2002年间中国大陆地区的H9N2 AIV可分为6个抗原群，不同抗原群之间抗原差异较大；Teng等[10]发现2009-2012年在中国分离的H9N2 AIV已经形成新的抗原亚组，与中国早期的H9N2分离株抗原性不同，其流行毒株与疫苗株之间存在抗原差异，从而可造成免疫失败引发疫情。

近年来，单克隆抗体广泛应用在流感病毒抗原变异的研究中，Wan等[11]采用抗H9N2 AIV HA的单抗在鸡胚中筛选逃逸突变病毒，并从中鉴定出9个关键氨基酸，这对于H9抗原图谱的绘制具有重要意义。Chen等[12]通过中和抗体筛选逃逸突变株的方法，发现8种抗H1N1亚型HA单克隆抗体识别HA抗原表位的Sa、Sb、Ca1和Ca2位点。氨基酸的变异可能会导致抗原性的变异，通过单克隆抗体来标记HA的抗原位点对抗原变异的研究以及疫苗的研制具有重要意义。

前期实验利用表达H9N2 AIV SH441毒株HA基因的真核表达质粒免疫小鼠已获得多株抗H9亚型HA蛋白的单克隆抗体，本研究在此基础上，成功筛选到4株抗H9亚型HA的广谱中和抗体1F2、1C5、3F7和4E7（本文未列出其他不具有广谱性的单克隆抗体），这些单克隆抗体将为H9N2 AIV通用疫苗研制及高通量抗体检测方法的建立提供重要材料。

1 材料和方法

1.1 主要材料Phanta高保真酶、同源重组酶购自Vazyme公司；胶回收试剂盒购自Axygen公司；EcoR I和XhoI限制性内切酶购自NEB公司；DH5α感受态细胞购自擎科生物公司；去内毒素中提质粒试剂盒购自QIAGEN公司；DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）购自Biosun公司；Opti-MEM购自Gibco公司；TransIT-293 Transfection Reagent购自Mirus Bio LLC公司；羊抗鼠FITC标记的IgG购自Thermo Fisher公司；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 病毒、质粒、载体和细胞A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2)(Ck/SH/441/2009)、A/Chicken/Jiangsu/825/2009(H9N2)(Ck/JS/825/2009)、A/Chicken/Jiangsu/925/2009(H9N2)(Ck/JS/925/2009)、A/Chicken/Jiangsu/A139/2010(H9N2)(Ck/JS/A139/2010)、A/Chicken/Shandong/2612/2010(H9N2)(Ck/SD/2612/2010)、A/Chicken/Anhui/B278/2011(H9N2)(Ck/AH/B278/2011)、A/Chicken/Guangdong/B527/2011(H9N2)(Ck/GD/B527/2011)、A/Duck/Anhui/C313/2012(H9N2)(Dk/AH/C313/2012)、A/Chicken/Guangdong/C76/2012(H9N2)(Ck/GD/C76/2012)、A/Chicken/Guangdong/D1389/2013(H9N2)(Ck/GD/D1389/2013)、A/Chicken/Anhui/D483/2013(H9N2)(Ck/AH/D483/2013)、A/Chicken /Henan/E3203/2014(H9N2)(Ck/HN/E3203/2014)、A/Chicken/Guangdong/F1650/2015(H9N2)(Ck/GD/F1650/2015)，质粒pCAGGS-H9、pCAGGS-H9N1SH5，pCAGGS空载体，293T细胞、MDCK细胞均由本实验室提供。

1.3 引物设计参照实验室前期测得的序列，通过Primer Primier 5.0软件设计各片段扩增所需引物（表1），在需要融合的片段上加入至少15 bp的重叠序列。同源重组引物在相应的位置加上至少15 bp的载体序列，以将其连接在载体上。

1.4 鸡胚中和实验用空白细胞培养液将SH441毒株稀释成200 EID50/100 μL，稀释好的病毒分别与单克隆抗体以及空白细胞培养液等量混和，充分混匀后37℃作用2 h；将混合液接入9～11日龄SPF鸡胚，每组3个鸡胚，每个鸡胚接种100 μL；37℃温箱孵育48 h后取尿囊液进行血凝实验。阳性血凝结果则表示病毒未被抗体中和，阴性血凝结果则表示病毒被抗体中和。

表1 各片段PCR扩增引物Table 1 Primers for every fragment

1.5 血凝抑制实验选择近年分离到的13株H9N2 AIV毒株，将毒株配制成8单位抗原，随后在血凝板加入25 μL/孔 PBS，第一列依次加入25 μL单克隆抗体细胞上清液，充分混匀后吸取25 μL于第2列，按照此方法2倍比稀释至第10列后吸取25 μL弃去。血凝板的前11列均加入25 μL已配制准确的8单位抗原，混匀室温作用30 min后，加入50 μL/孔0.5%鸡红细胞悬液，轻轻混匀，静置30 min后读数，以完全抑制8单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价。以不具有广谱性的单克隆抗体10F3作为对照。

1.6 间接免疫荧光实验将MDCK细胞以合适的比例铺匀至24孔板中，待长至80%～90%时弃去培养液，用无菌PBS清洗1次后备用；将13株H9N2毒株用无血清培养基2000倍稀释接种在洗涤过的MDCK细胞中，在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h；弃去细胞上清液，固定、通透、封闭后，将单克隆抗体和羊抗鼠FITC37℃作用1 h，每次均用PBS洗涤3次；最后使用荧光显微镜观察并拍照。以不具有广谱性的单克隆抗体10F3作为对照。

1.7 重组质粒的构建pCAGGS-H9是将H9亚型优化的SH441毒株的HA片段插入到真核表达载体pCAGGS β-actin启动子的下游；pCAGGS-H9N1 SH5是将优化的SH441毒株的HA片段和N1亚型的NA片段依次插入到真核表达载体Huang4 β-actin启动子下游，H5亚型HA片段插入到SV40启动子下游。以pCAGGS-H9N1SH5为模板分别扩增H9和H5；再以H9为模板扩增H9HA1和H9HA2，同理得到H5HA1和H5HA2；随后通过引物PCS-H9HA1-F和PCS-H5HA2-R将H9HA1和H5HA2融合成1个片段H9HA1-H5HA2，同理得到片段H5HA1-H9HA2。将融合得到的2个片段通过同源重组反应与酶切纯化过的pCAGGS载体连接重组；随后将连接产物转化至DH5α感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性的菌液进行测序，测序正确的菌液通过去内毒素中提质粒试剂盒提取质粒，分装，-20℃保存备用。

图1 重组基因结构示意图Fig.1 Schematic diagram of recombinant gene structure

1.8 间接免疫荧光检测单克隆抗体作用区域利用293-Mirus转染试剂将2个HA重组嵌合质粒pCAGGS-H9HA1-H5HA2、pCAGGS-H5HA1-H9HA2分别转染至生长密度为80%～90%的293T细胞，并且转染pCAGGS-H9作为阳性对照，pCAGGS空质粒作为空白对照，在37℃、5% CO2培养箱培养24 h后做间接免疫荧光实验，使用荧光显微镜观察并拍照。

2 结果

2.1 中和实验结果将单克隆抗体1F2、1C5、3F7和4E7与SH441病毒的混合液接种鸡胚，48 h后取尿囊液经血凝实验测定均没有血凝现象，空白培养液与SH441病毒的混合液存在血凝现象，且血凝价为211，结果与SH441病毒自身的血凝价相同，说明这4株单克隆抗体对于SH441病毒均存在中和活性。

2.2 血凝抑制实验结果通过血凝抑制实验检测单克隆抗体对不同H9N2 AIV的反应性，结果见表2。其中1F2、1C5、3F7和4E7对这13株2009-2015年间分离到的H9N2 AIV都具有较强的反应性，而10F3与2009年的毒株反应性较强，与2009年以后的毒株反应逐渐减弱。

表2 单克隆抗体与不同H9N2亚型禽流感病毒血凝抑制交叉反应结果Table 2 The HI results of different H9N2 AIV against MAbs

2.3 间接免疫荧光实验结果通过间接免疫实验检测不同的H9N2 AIV感染MDCK细胞后与单克隆抗体的反应性，1F2、1C5、3F7和4E7对这13株毒株均可见明显的绿色荧光，其中1F2、1C5、3F7和4E7与SH441毒株反应结果见图2。10F3与2009年的毒株反应可见明显的荧光，与2009年后的毒株反应荧光较弱，甚至没有荧光（表3）。

2.4 重组质粒的鉴定以构建质粒为模板，使用引物对PCS-H9HA1-F和PCS-H5HA2-R扩增H9HA1-H5HA2，引物对PCS-H5HA1-F和PCS-H9HA2-R扩增H5HA1-H9HA2，1%琼脂糖电泳检测，均扩增出约1700 bp的特异性条带，与预期大小一致（图3）。将质粒测序，测序结果经比对与预期一致。

图2 4株单克隆抗体在MDCK细胞上与SH441毒株反应的IFA结果Fig.2 The IFA results of MAbs against SH441 virus in MDCK cells

2.5 间接免疫荧光检测单克隆抗体作用区域结果结果见表4，1F2、1C5、3F7和4E7均与pCAGGSH9HA1-H5HA2和pCAGGS-H9反应，有明显的绿色荧光，而与pCAGGS-H5HA1-H9HA2和pCAGGS空质粒都不反应，这说明1F2、1C5、3F7和4E7作用位点都位于HA1区域。

表3 单克隆抗体与不同H9N2亚型禽流感病毒间接免疫荧光实验结果Table 3 The IFA results of different H9N2 AIV against MAbs

图3 重组质粒的PCR鉴定Fig. 3 Identification of recombinant plasmids by PCR

表4 单克隆抗体与HA重组质粒IFA结果Table 4 The IFA results of MAbs with HA recombinant plasmids

3 讨论

本研究中选择了13株2009-2015年间不同地域分离到的H9N2 AIV，HA基因皆属于Ck/BJ/1/1994分支下的Subgroup Ⅱ亚分支，彼此抗原性存在差异。HI和IFA实验表明，10F3与2009年毒株具有较强反应性，与2009年以后毒株反应性逐渐减弱，说明其识别的是一个易变异的表位，这13株毒株的抗原性在不断的发生变化；而1F2、1C5、3F7和4E7与这些毒株都具有较强的反应性，说明这4株单克隆抗体具有广谱反应性，其识别的可能是一个保守表位。

本研究构建了H9亚型与H5亚型HA的嵌合质粒，目的是为了检测单克隆抗体的作用位点是位于HA1或者HA2亚基，结果显示这5株单克隆抗体位于HA1亚基。在流感病毒感染或者疫苗免疫的过程中，引发体液免疫产生的抗体通常针对HA的头部对机体产生保护，但是这类抗体普遍具有毒株特异性；另一类抗体针对HA茎部保守区域，可以阻止不同亚型的流感病毒[13-14]，有研究报道，相较于针对HA头部和受体结合区域的抗体，流感病毒更难逃逸针对茎部的广谱抗体[15]。

总之，本研究筛选到4株广谱具有中和活性抗H9亚型HA的单克隆抗体，且其作用位点在HA1区域，这些单克隆抗体将为H9N2 AIV通用疫苗研制及高通量抗体检测方法的建立提供重要材料。