许何丽， 徐国伟， 毛亚萍， 窦文静， 王主， 段晓旭*

（1. 沈阳医学院公共卫生学院预防医学专业2016 级， 辽宁 沈阳110034； 2. 中国医科大学公共卫生学院环境与慢病研究中心； 3. 沈阳医学院公共卫生学院毒理学教研室； 4. 沈阳医学院公共卫生实验教学中心）

砷是地壳中普遍存在的元素之一， 长期砷暴露严重威胁人类健康， 可导致皮肤癌、 膀胱癌、肺癌等多器官损害。 除了致癌性， 流行病学和实验研究还发现砷具有一定的免疫调节效应［1－2］， 这正成为砷研究领域一个新的热点问题。 无机砷可以诱导巨噬细胞分化和吞噬能力减弱、 朗格汉斯细胞和树突状细胞的数目明显减少以及Th17 细胞特异性转录因子维甲酸相关孤核受体γt （retinoidrelated orphan receptor gammat， RoRγt） 及T 细胞增殖能力下降［3］。 除脾、 胸腺这些免疫器官外，越来越多的研究提示机体内一些非免疫器官中也含有巨噬细胞、 树突状细胞、 淋巴细胞等免疫细胞， 并且这些免疫细胞可以参与机体的免疫调节，从而参与一些免疫和非免疫性疾病的发生发展。如肾脏中含有存在由树突状细胞和巨噬细胞构成的肾单核吞噬细胞系统及部分CD4＋／CD8＋组织常驻记忆T 细胞（tissue－resident memory T cell， Trm细胞） 和Treg 细胞等， 这些免疫细胞组成的免疫微环境可以调节机体的免疫应答及肾脏的防御功能［4－5］。 肾脏是砷排泄、 蓄积和发挥毒作用的主要靶器官， 砷暴露增加大鼠肾脏中TNF－α、 NF－κB和IL－1β 等的表达［6］。 这些结果提示砷引起肾损伤的过程中或多或少的会捕捉到免疫反应的“踪迹”， 但目前关于砷对肾脏的免疫学相关研究尚不多见。 本研究采用整体动物学模型， 探讨急性砷暴露对小鼠肾脏内抗原吞噬、 趋化黏附和抗原提呈功能的影响， 为砷所致肾损伤提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级C57BL／6 雌性小鼠40 只，体重18～22 g， 由北京维通利华公司提供， 实验动物许可证号11400700063049， 饲养于沈阳医学院实验动物中心。 本实验遵循沈阳医学院有关实验动物管理和使用以及国家《关于动物伦理与福利的作者指南共识》 的规定。

1.2 仪器与试剂 超高速低温离心机（美国Heal Force 公司）， Infinite M200 型微孔板发光检测仪（瑞士Tecan 公司）， Nano Drop ND－2000 分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司）， ABI 7500实时定量PCR 仪 （美国ABI 公司）， 亚砷酸钠（NaAsO2） （分析纯， 美国Sigma 公司）； Trizol 试剂盒和SYBR Premix Ex Taq II Real－time PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司）， 尿素氮（BUN）、 肌酐（Cr）、 酸性磷酸酶（ACP） 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 方法

1.3.1 砷溶液配置 将2.5 g NaAsO2粉末， 溶于100 ml 纯净水中， 配置成浓度为25 g／L 的砷储备液， 逐步稀释为0.125、 0.25 和0.5 g／L 的砷溶液用于实验。

1.3.2 模型建立 将小鼠随机分为4 组， 分别为对照组、 2.5、 5 和10 mg／kg NaAsO2暴露组， 各10 只。 一次性灌胃方式染毒， 染毒时间为24 h，对照组给予生理盐水。 记录小鼠染毒前后体重变化。 染毒终点眼球取血用于生化指标测定， 处死解剖， 摘取完整的肾脏， 记录小鼠肾脏重量。

1.3.3 生化检测 取各组小鼠外周血并分离出血清， 按照试剂盒说明书检测血清中BUN、 Cr 和ACP 水平， 检测肾组织匀浆中ACP 水平。

1.3.4 Real－time PCR 法检测肾脏免疫功能 将收集的肾组织充分匀浆， 加入Trizol 溶液中， 提取组织中的总RNA， 反转录合成cDNA 后， 测定肾脏趋化黏附功能分子（Ccr5、Ccr7、Icam1） 和抗原提 呈 功 能 相 关 分 子 （MhcⅡ、Cd80、Cd86、Cd40） 的表达， 严格按说明书配制反应体系并在相应条件下进行扩增。 反应结束后， 根据溶解曲线判断待扩增基因的特异性， 采用2－△△Ct值表示各目的基因的mRNA 相对表达量， 各引物序列见表1。

表1 引物序列

续表1

1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0 软件对数据进行统计学分析， 计量资料以均数±标准差表示， 组间比较采用单因素方差分析， 两两比较采用LSD－t法（满足方差齐性时） 或Dunnett’ T3 法（不满足方差齐性时）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较 实验期间， 各组小鼠生长良好， 活动灵敏， 大便成型， 毛发顺齐， 均存活且未见明显的系统毒性。 各组小鼠染毒前后体重无明显变化， 与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）， 砷暴露组小鼠的肾脏重量及脏器系数均无明显变化（P＞0.05）， 见图1。

图1 各组小鼠一般情况比较

2.2 血清BUN 和Cr 水平比较 与对照组比较，砷暴露组小鼠血清BUN 水平明显增加（P＜0.05），见图2A； 而4 组小鼠血清Cr 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）， 见图2B。

2.3 砷暴露对小鼠肾脏抗原吞噬功能的影响 与对照组比较， 血清ACP 水平降低（P＜0.05）， 见图3A； 肾组织中ACP 水平升高（P＜0.05）， 见图3B。

2.4 砷暴露对小鼠肾脏趋化黏附功能的影响 砷暴露组小鼠肾组织中Ccr5、Ccr7的mRNA 水平随着染毒剂量的增加逐渐下降， 10 mg／kg 砷暴露组与其它组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图4A、 B； 与对照组比较， 砷暴露组Icam1的mRNA 水平均出现不同程度的下降， 5 mg／kg 砷暴露组与2.5 mg／kg 和10 mg／kg 砷暴露组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）， 见图4C。

图2 对照组和砷暴露组小鼠血清BUN 和Cr 水平比较

图3 对照组和砷暴露组小鼠血清和肾组织ACP 水平比较

2.5 砷暴露对小鼠肾脏抗原提呈功能的影响 与对照组、 2.5 mg／kg 砷暴露组比较， 5 和10 mg／kg砷暴露组肾组织中MhcⅡ的mRNA 水平随着染毒剂量的增加逐渐下降， 5 和10 mg／kg 砷暴露组比较差异有统计学意义（P＜0.05）， 见图5A； 与对照组比较， 砷暴露组Cd80与Cd86的mRNA 表达水平明显下降（P＜0.05）， 与2.5 mg／kg 砷暴露组比较， 5 和10 mg／kg 砷暴露组Cd80的mRNA 表达水平明显升高， 见图5B、 C； 而Cd40的mRNA 水平与对照组相比无明显变化（P＞0.05）， 见图5D。

图4 对照组和砷暴露组小鼠肾脏组织中Ccr5、Ccr7 和Icam1 的mRNA 表达水平比较

图5 对照组和砷暴露组小鼠肾组织中MhcⅡ、 Cd80、Cd86 和Cd40 的mRNA 表达水平比较

3 讨论

众所周知， 肾脏是砷毒性及其代谢的主要靶器官之一， 长期砷暴露可以影响肾脏的生理功能，引起肾损伤， 甚至导致肾癌等。 随着免疫学研究的进展， 研究发现非免疫器官肾脏中也含有树突状细胞、 巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞组成的免疫微环境， 也发挥着一定的免疫调节效应［4－5］。

BUN 是蛋白质代谢的主要终产物， 而Cr 是肌肉在体内代谢的产物， 二者主要通过肾小球滤过排出体外， 故血清BUN 和Cr 是评价肾脏功能的重要指标［7］。 本研究发现与对照组比较， 砷暴露组小鼠血清BUN 的水平明显增加， 差异有统计学意义， 而血清Cr 的水平无明显差异。 Mahajan 等［8］研究发现Wistar 大鼠50 ～150 μg／L 砷暴露28 d，其血清BUN 和Cr 明显增加。 徐昉等［9］的研究结果显示长期低剂量砷摄入时， 随着时间的延长， 血清BUN 和Cr 才呈明显升高， 这提示血清Cr 的水平变化不明显可能与BUN 和Cr 的代谢部位不同和染毒时间过短有关。 人群流行病学研究发现饮水型砷中毒病区居民血清BUN 平均水平高于非高砷区居民［10］， 这些结果均提示砷暴露能够引起肾功能的损害。

ACP 是溶菌体酶的重要组分， 存在于前列腺、肝和肾等多种组织和体液中， 可以直接参与蛋白质、 糖类和脂类的吞噬作用， 具有防御和免疫调节等生理功能［11］。 本研究结果发现， 与对照组比较， 砷暴露小鼠血清中ACP 的活性明显下降， 肾脏中ACP 活性升高， 差异有统计学意义。 Rana等［12］研究发现Wistar 大鼠20 mg／L 砷染毒3 个月，血清中ACP 水平明显高于对照组。 田耕晨［11］等研究指出， 三角帆蚌在受到免疫激活时， 血清中ACP 呈现明显先升后降趋势。 本研究结果在一定程度上可以推断是与血清和肾脏组织对外源性物质刺激时反应快慢不同有关。 同时， 也可能与染毒的时间和动物的种属不同有关。

Ccr5 和Ccr7 是树突状细胞表面的趋化因子受体； Icam 既是细胞间黏附分子又是抗原提呈细胞上的协同刺激分子， 这些分子均调节机体的免疫反应［13］。 本研究发现与对照组比较， 10 mg／kg 砷暴露明显降低小鼠肾脏组织中Ccr5、Ccr7的mRNA的表达， 砷暴露明显降低小鼠肾脏组织中Icam1的mRNA 的表达， 差异均有统计学意义。 Zhao 等［14］研究发现C57BL／6 小鼠饮用含砷（0.1、 0.1、 1、10 mg／L NaAsO2） 水12 个月后， 脾和肺组织中Ccr5和Ccr7的mRNA 水平明显高于对照组。 另一项研究发现100 μg／L 砷暴露明显增加小鼠肾脏Icam1 的蛋白水平［15］。 这些结果的不一致可能与砷的剂量、 持续时间及作用的靶器官的不同有关，还需要进一步研究和探讨。 本研究结果提示砷引起的肾脏组织中趋化黏附因子的表达水平的下降可能参与砷的免疫调节效应。

多种免疫细胞表面分布有Cd40、 Cd80 和Cd86 等多种分化抗原， 具有多种生物学功能。Cd40 与Cd40 的受体Cd40L 结合后可上调其表面的Cd80、 Cd86 及MhcⅡ的表达， 增强抗原提呈的作用［16］。 本研究发现与对照组比较， 砷暴露小鼠肾组织中MhcⅡ、Cd80和Cd86分子的mRNA 水平明显下降， 差异均有统计学意义。 Bahari 等［17］研究发现树突状细胞经1μg／L 砷处理12 h 和24 h后， Cd40 和MhcⅡ分子的表达下降， 影响树突状细胞的分化和成熟。 Macoch 等［18］的研究也发现，1～2 μmol／L 砷会抑制树突状细胞表面共刺激分子Cd80 和Cd86 的表达。 这些结果均提示砷暴露可以抑制机体的抗原提呈功能。

综上所述， 本研究发现急性砷暴露破坏小鼠肾脏内抗原吞噬功能分子ACP 的活性， 抑制趋化黏附功能相关分子（Ccr5、 Ccr7 和Icam1） 以及抗原提呈功能相关分子（MhcⅡ、 Cd80 和Cd86） 表达， 从而破坏肾脏正常的免疫功能， 进而导致肾脏损伤， 为砷导致肾脏免疫损伤提供了理论依据。