何 权，刘丹瑜，叶 君，张艳丽，朱华栋，蒋澄宇*，徐 军*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系，北京 100005；2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 急诊科，北京 100730；3.北京大学第一医院呼吸和危重症医学科，北京 100034)

肺炎(pneumonia)是一种由多种病原体引起的下呼吸道感染性疾病[1]。根据患病环境可以将肺炎分为社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)和医院获得性肺炎(hospital-acquired pneumonia,HAP)等[2]。其中，CAP是一种常见的肺炎类型，是发达国家常见的因感染致死的疾病之一[3]。CAP是指在医院外罹患的感染性肺实质(含肺泡壁，即广义上的肺间质)炎性反应，包括具有明确潜伏期的病原体感染在入院后于潜伏期内发病的肺炎。在过去的几十年中，肺炎的诊疗策略已经得到了显著的改善，但CAP的发病率和病死率仍处于很高的水平，尤其是重症社区获得性肺炎(severe community-acquired pneumonia,SCAP)。临床数据显示，CAP的总体病死率为13%，但SCAP的病死率高达35%以上[4]。

SCAP的病死率与疾病严重程度和预后密切相关。国际指南建议使用不同的临床评分标准对CAP的严重程度进行分级，目前常用的包括肺炎严重指数(pneumonia severity index,PSI)评分、CURB-65评分以及CRB-65(C:意识障碍，U:尿素氮，R:呼吸频率，B:血压，65:年龄)评分等[5]。但这些临床评分标准的检测指标较多，且在非典型的临床病例中也具有一定的局限性。因此，利用生物标志物对预后情况进行预测引起了广大科研工作者的关注。在生物样本的检测中，代谢组学可以特异性识别低分子量的内源性代谢物并发现潜在的生物标志物[6-7]。本研究拟通过代谢组学的分析方法，探寻能够预测SCAP预后的潜在生物标志物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:根据纳入排除标准收集并筛选2015年1月至2019年6月北京协和医院急诊重症监护病房的68例SCAP患者以及30名健康志愿者，收集血液样本。本研究经北京协和医学院医学伦理委员会批准(伦理审批文号：S500)并获得受试者签署的知情同意书。纳入标准：入住北京协和医院急诊重症监护病房并诊断为CAP的患者；符合中华医学会呼吸病学分会SCAP的诊断标准；签署知情同意书。排除标准：入院24 h内未采集血样；拒绝签署知情同意书；发病时间>10 d。

1.1.2 试剂:甲醇、甲酸和乙腈(CNW公司);L-2-氯苯丙氨酸(上海恒创生物科技有限公司);LysoPC17:0(Avanti公司)。

1.2 方法

1.2.1 临床血液样本前处理:收集68例成人SCAP患者和30名成人健康志愿者的外周血液样本于抗凝离心管中。将血液样本以4 ℃、3 000 r/min的条件离心15 min。离心完成后将上层血浆样本收集并置于-80 ℃保存。

1.2.2 代谢组学的分析:色谱条件：采用ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)进行色谱分离，色谱柱的柱温为45 ℃，流速为0.4 mL/min。A流动相为水(含0.1%甲酸)，B流动相为乙腈/甲醇(2/3)(v/v)(含0.1%甲酸)。进样体积为1 μL。洗脱梯度见表1。

表1 液相色谱洗脱梯度Table 1 Liquid chromatography elution gradient

1.3 统计学分析

原始数据经代谢组学处理软件Progenesis QI v2.3 软件(Nonlinear Dynamics,Newcastle,UK)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化。

2 结果

2.1 健康对照与SCAP患者一般资料

健康对照与SCAP患者在性别及年龄上差别无统计学意义。

2.2 健康对照与SCAP患者之间的差异代谢物

多元统计分析OPLS-DA得分图显示健康对照和SCAP患者具有显著的组间差异，组内差异较小(图1A)，且OPLS-DA模型具有稳定性和可靠性(图1B)。根据OPLS-DA模型得到VIP值，根据VIP>1的条件筛选得到224个差异代谢物。根据P值和FC(P<0.05,FC>2或者FC<0.5)进行差异筛选，得到1 316个差异代谢物(图2)。进一步结合单变量统计分析和多元统计分析，最终得到健康对照和SCAP患者之间的差异代谢物共126个。

2.3 5-羟色胺可以预测SCAP患者的预后

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)水平在SCAP预后存活组与死亡组间存在显著差异(图3A)，可以预测SCAP患者预后情况(图3B)。5-HT水平越低，SCAP患者最终死亡的可能性越大，且与患者的性别和年龄无关(表2)。

2.4 5-羟色胺与氧合指数呈正相关，与急性生理与慢性健康评分 II负相关

在SCAP患者中，存活组的氧合指数(oxygenation index,OI)高于死亡组，急性生理与慢性健康评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)低于死亡组(表3)。此外，5-HT与OI呈正相关，与APACHE Ⅱ评分水平呈负相关，与SCAP患者的临床指标具有相关性(图4)。

A.OPLS-DA score plots for healthy and SCAP patients(R2X=0.653,R2Y=969,Q2=0.886);B.validation plots obtained from 999 permutation for healthy and SCAP patients;the stability and credibility were supported by the result that all permuted R2 and Q2 values on the left were lower than the original point on the right,and that the Q2 regression line in blue had a negative intercept图1 代谢谱分析结果的OPLS-DA得分图和响应排序检验图Fig 1 OPLS-DA score plots and validation plots for metabolic profiling results

The green dots represented FC<0.5 and P value <0.05 between healthy and SCAP;The red dots represented FC>2 and P value <0.05 between healthy and SCAP;The gray dots represented no significant difference between healthy and SCAP图2 健康对照和SCAP患者的火山图Fig 2 Volcanic map in healthy and SCAP groups

3 讨论

5-羟色胺(serotonin,5-hydroxytryptamine,5-HT)，又名血清素，是一种神经递质，参与调节机体内的多种生物学过程[8]。除了中枢神经系统以外，5-HT在免疫系统中也发挥了重要作用。多种免疫细胞，包括巨噬细胞、T细胞、肥大细胞和树突状细胞等，均具有合成、储存和转运5-HT的能力[9]。但机体内有将近95%的5-HT都是由肠粘膜中的肠嗜铬细胞(enterochromaffin cell,EC)合成的[10]。研究表明，5-HT参与肠道色氨酸代谢的关键途径，在炎性肠病中具有重要调节作用[11]。

本研究结果显示健康对照的5-HT水平高于SCAP患者组，并且SCAP患者的5-HT水平在存活与死亡组中存在显著性差异。死亡组的5-HT水平显著低于存活组，提示5-HT水平越低，SCAP患者的预后情况可能越差。OI是反映细胞外供氧水平的指标，可以反映组织的供氧量和氧气需求量。OI也是危重患者预后的重要预测指标，动态监测OI可以有效指导治疗方案并评估预后[12-13]。APACHE Ⅱ评分常用于评估ICU患者病情的严重程度，临床上一般以初入ICU的24 h内的评分作为初步判断。APACHE Ⅱ评分越高，患者的预后越差[14]。本研究发现5-HT水平与OI正相关，与APACHE Ⅱ评分负相关。此外，存活组的OI水平高于死亡组，而APACHE Ⅱ评分低于死亡组。这进一步说明5-HT的水平可以反映SCAP患者的预后情况，有望成为预测SCAP预后的生物标志物，对SCAP患者的临床治疗和预后评估具有重要指导意义。

A.boxplots of 5-HT level of healthy (n=30),survive patients (n=49) and non-survive patients (n=19),*P<0.001,Kruskal Wallis test;B.receiver operating characteristic curve(ROC) of 5-HT level according to prognosis (survive or non-survive),AUC=0.762,P<0.05 was considered as significant differences图3 健康对照和不同预后SCAP患者的5-羟色胺箱图及ROC曲线Fig 3 Boxplots and ROC curve of 5-HT level in healthy people and SCAP patients with different prognosis

表2 5-HT的独立因子检验Table 2 Independent factor test of 5-HT for prognosis

表3 SCAP患者基本信息和临床指标Table 3 Basic information and clinical indicators of SCAP patients

本文研究的患者人群为重症社区获得性肺炎，并没有研究中度和轻度社区获得性肺炎以及医院获得性肺炎的患者，具有一定的局限性。未来可纳入不同严重程度和医院获得性肺炎的患者人群，探寻5-HT是否适用于此类人群，增加5-HT的适用范围。

A.5-HT level of plasma was positive correlated with OI,r=0.356,P=0.002 9;B.5-HT level of plasma was negative correlated with APACHE Ⅱ score,r=-0.428,P=0.000 3;Pearson rank correlation analy-sis (r) and P value were provided in each graph图4 SCAP血浆5-HT水平与氧合指数和APACHE Ⅱ评分的相关性图Fig 4 Correlation graphs of 5-HT level of plasma and OI,APACHE Ⅱ score in SCAP patients