江 浩，赵 凡，喻家键，王红珠，孙晓伟，高 慧

（温州医科大学公共卫生与管理学院，浙江 温州 325035）

纳米颗粒，又称超细粒子，其粒径介于1～100nm之间，具有宏观材料不具有的许多优异特性，如表面效应、小尺寸效应和量子隧穿效应等［1］。随着纳米技术的飞速发展，纳米产品逐渐进入人们的日常生活。纳米银颗粒（silver nanoparticles，Ag-NP）直径一般在25～50 nm之间，由于它的低毒性、高抗菌性和广泛的抗菌谱，已发展成为使用最广泛的无机抗菌材料［2］。研究发现，Ag-NP具有多方面的毒性效应，如细胞毒性［3-4］、遗传毒性［5］和神经系统毒性［6-7］等，而且它的毒性大小还与粒径和剂量相关。IVASK等［8］通过研究不同粒径的Ag-NP对哺乳动物细胞的杀伤作用时发现，Ag-NP径越小，越容易穿过屏障，它的毒性也就越强。体内生殖毒性实验表明，BALB/C小鼠在暴露于Ag-NP时，Ag-NP可通过胎盘屏障或母乳而传递给后代，并可能导致胚胎发育迟缓［9］。因此，研究Ag-NP的毒性效应及其作用机制具有重要的现实意义。

在动物和人类的生命过程中，干细胞保留了复制和分化成组织中所有类型细胞的潜能［10］，该过程主要由组织特异性干细胞的对称或非对称分裂形成。乳腺干细胞是一类成体干细胞，它对于雌性哺乳动物在青春期、妊娠期、泌乳期和衰退期中乳腺的生长发育和泌乳等过程发挥着重要的作用。学者们通过不同的特异标记对小鼠不同乳腺上皮细胞群进行分选，并通过移植得到了具有再生能力的特异细胞群。直到2006年，研究发现单个乳腺干细胞可形成完整的再生乳腺，并由此证实了乳腺干细胞的存在［11］。随着对乳腺干细胞研究的不断深入，现已可通过CD24，CD29和CD49f等表面抗体成功分离得到小鼠的乳腺干细胞。啮齿类动物乳腺发育和活动过程中有2种主要的上皮细胞：含有乳腺干细胞的基底细胞和含有乳腺祖细胞的管腔细胞［12-13］。研究发现，包括乳腺癌干细胞在内的肿瘤干细胞可能源于自我更新机制出现异常变化的正常干细胞，干细胞随着化学毒物暴露增加而易累积基因突变，且其又能自我更新，因而被许多学者认为其可能是乳腺癌的原发细胞［14-16］。Ag-NP暴露于细胞，也可被某些细胞膜受体识别，如N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR），经过内吞作用进入细胞中，最终进入线粒体等细胞器中，破坏它们的正常功能，进而导致细胞凋亡［17］。其次，氧化应激也是Ag-NP产生毒性效应的一个重要诱因。Ag-NP可直接刺激细胞产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），也可诱导细胞发生炎症反应，间接诱导生成ROS，而ROS水平的增加可引起线粒体内膜的损伤，最终导致遗传毒性和细胞毒性［18-19］。有研究发现，Ag-NP产生的细胞毒性与其释放的银离子有重要的关系，但Ag-NP本身也会对这种毒性效应具有协同作用［20］。目前Ag-NP对乳腺干细胞的影响尚未有研究报道。本研究通过孕期Ag-NP暴露研究其对乳腺干细胞产生毒性效应，探讨Ag-NP增加乳腺癌发生风险的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

Ag-NP（纯度99.5%，直径＜100 nm）、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）、B-27、肝素、胰岛素、氢化可的松、庆大霉素、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美国Sigma公司）；氯化铵溶液、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、DNAse I、小鼠上皮细胞富集试剂盒、Dispase、大鼠抗小鼠CD24-PE M1/69单克隆抗体、Mammocult基础培养基和Mammocult Proliferation supplement（加拿大 Stem Cell公司）；大鼠抗小鼠CD49f-PE/Cy7 CoH3多克隆抗体（美国Biolegend公司）；Streptavidin-APC（美国Invitrogen公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；小鼠抗小鼠环氧化酶2（cyclooxygenase-2，Cox-2）单克隆抗体、小鼠抗小鼠信号转导和转录活化蛋白5（signal transducer and activator of transcription 5，Stat5）单克隆抗体和小鼠抗小鼠K8单克隆抗体（美国Santa公司）；兔抗小鼠K14单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体（中国碧云天公司）；山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor®488）抗体和山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor®555）抗体（美国Abcam公司）。其余试剂均为分析纯。

动物麻醉系统（美国Microflex公司）；石蜡切片机（德国Leica公司），流式细胞仪（美国BD公司），光学显微镜（日本尼康公司），二氧化碳培养箱（美国Thermo公司），KQ5200E型超声波清洗器（昆山超声仪有限公司）。

1.2 动物

10周龄FVB-GFP小鼠购买于美国的Jackson实验室，在动物房繁殖。整个实验过程严格按照温州医科大学动物管理中心实验动物规则饲养。饲养过程中使用的聚丙烯材质的饲养笼及玻璃饮水瓶，饲料符合美国营养学会（American Institute of Nutrition）标准，笼具、饮用水和饲料中均不含Ag-NP，可排除外界环境因素对实验的干扰。

1.3 小鼠分组和染毒

10只10周龄雌性小鼠根据体质量随机分成2组，每组5只。将每2只雌鼠与1只雄鼠进行合笼，在看到雌鼠阴道栓的当天记作孕0天（pregnancy 0，P0）。将Ag-NP加到超纯水中，40 kHz超声15 min，使之混悬（Ag-NP表征图见图1）。根据文献报道，在孕期敏感窗口期于P12正常对照组ig给予超纯水，Ag-NP组ig给予Ag-NP混悬液5 mg·kg-1［21-24］连续7 d。子代小鼠19日龄时雌雄分笼，饲养条件均按1.2进行，待子代小鼠3月龄时进行指标检测。

Fig.1 Transmission electronic micrograph of silver nano particles（Ag-NPs）.

1.4 子宫、乳腺和肝组织的收集和处理

子代小鼠3月龄时，颈椎脱臼处死，记录体质量。取小鼠子宫和肝，称重并拍照。取小鼠右侧2个乳腺置于消化液中，制备单细胞悬液，用于流式分选；分选后得到的乳腺干细胞用于2D集落形成实验；收集2D集落形成实验中的集落，用于免疫荧光染色和Giemsa染色；左侧腹股沟处乳腺用于洋红-硫酸铝钾乳腺整体染色；左侧胸腺处乳腺置于4%甲醛溶液中固定，用于HE染色和免疫组织化学染色。

1.5 子宫长度和直径的检测

取1.4制备的小鼠子宫自然摆放在手术垫上，用游标卡尺测量记录小鼠子宫的长度和直径。

1.6 洋红-硫酸铝钾染色观察乳腺导管形态

取小鼠1.4制备的腹股沟乳腺，固定液中固定10 h后分别经70%乙醇、50%乙醇和双蒸水浸泡后，加洋红-硫酸铝钾染液染色过夜，第2天去除染液后，经70%乙醇、95%乙醇和无水乙醇脱水后加二甲苯浸泡1 h进行透明化处理。镜下拍照观察乳腺形态。Image J软件定量淋巴结面积。

1.7 HE染色观察乳腺导管增生

取1.4制备的左侧胸腺乳腺石蜡切片4 μm厚。70℃烤片机上烤片15 min后二甲苯脱蜡，经无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇和双蒸水浸泡后苏木精染色5 min，1%盐酸乙醇分化10 s后置双蒸水中终止分化。切片经80%乙醇、95%乙醇处理后伊红染色30 s，无水乙醇脱水后，二甲苯透明化处理，树脂封片。镜下观察计数增生的乳腺导管。导管增生比例（%）=增生导管数/总导管数×100%。

1.8 流式细胞术检测小鼠乳腺的干细胞亚群

取1.4制备的右侧乳腺组织置消化液中，在37℃二氧化碳恒温培养箱中消化15 h后，依次用氯化铵、胰蛋白酶EDTA、中性蛋白酶和DnaseⅠ进行处理，40 μm滤网过滤得到单细胞悬液。500×g离心5 min后加入HBSS，细胞重悬后先加生物素标记的小鼠上皮细胞富集试剂盒（小鼠乳腺细胞）cocktail，冰上静置15 min后清洗，离心重悬，分别加不同荧光素标记的CD24-PE、链霉亲和素、CD49f-PE/Cy7抗体，避光孵育15 min后离心，细胞重悬于细胞培养基中。流式细胞仪设置相应的分选门分选收集细胞，采本实验室建立的乳腺干细胞定量方法［12］进行定量分析乳腺重建单元（mammary repopulation unit，MRU）百分比、基底细胞和管腔细胞的比值（luminal to basal，L/B）、集落形成细胞（colony forming cell，CFC）百分比和管腔干细胞（luminal progenitor，LP）频率。

1.9 集落形成实验和免疫荧光染色检测乳腺管腔干细胞亚群集落百分比

12孔板提前培养小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3），2 d后，弃培养液。向12孔板中加CFC培养基（Mammocult基础培养基再加10%Mammocult proliferation supplement、2%B-27、5%FBS、bFGF 20 μg·L-1、EGF 20 μg·L-1、肝素 10 mg·L-1、胰岛素10 mg·L-1、氢化可的松1 mg·L-1和庆大霉素50 mg·L-1），取1.8制备的小鼠乳腺管腔干细胞每孔加1000个分选出的管腔细胞，24 h后换成MM培养基进行贴壁培养。9 d后，去培养基，冰甲醇固定，然后用0.3%PBST破膜，PBS洗涤。用10%血清封闭后，4℃一抗（K8 1∶200，K14 1∶500）孵育过夜。第2天，去一抗，加相应二抗（1∶1000）孵育，最后去二抗，加DAPI和抗荧光淬灭剂，在荧光显微镜下分别计数K8+K14+，K8+K14-和K8-K14-3种管腔干细胞亚群集落并拍照。

1.10 Giemsa染色计数总集落数

取1.9制备的集落，弃集落培养液后加PBS轻轻清洗2次，然后即加适量冰甲醇固定，15 min后吸去冰甲醇用PBS清洗2次，然后加Giemsa染液染色30 min。PBS洗去多余的染液晾干后显微镜下计数集落数（细胞≥50个为1个集落）。

1.11 免疫组织化学检测乳腺导管Cox-2和Stat5蛋白表达

取1.4制备的小鼠左侧乳腺组织石蜡包埋后，4 μm切片。组织切片二甲苯脱蜡，浸到梯度乙醇中进行水合，然后置提前预热的抗原修复液中（Cox-2柠檬酸钠pH6.0，Stat5 Tris/EDTA pH9.0）抗原修复15 min后，置封闭内源性过氧化物酶中。取出进行细胞透膜，然后10%二抗种属来源血清封闭和一抗（Cox-2 1∶400，Sata5 1∶200）孵育。4℃过夜后，去一抗，二抗（山羊抗小鼠1∶100）孵育1 h后，避光染DAB。观察到棕色后，进行苏木精复染，乙醇脱水，最后封片保存。显微镜下拍照，使用Image-Pro Plus软件检测染色导管的积分吸光度值（integrated absorbance，IA），表示蛋白相对表达水平。IA=总吸光度值/染色总面积。

1.12 统计学分析

2 结果

2.1 孕期纳米银暴露对子代成年雌性小鼠体质量、存活率、子宫直径和长度的影响

图2A～2D可见，孕期暴露Ag-NP后，子代小鼠的子宫形态未发生明显变化。与正常对照组相比，Ag-NP染毒组子代小鼠存活率无统计学差异（如图2E），子代小鼠体质量为（25.7±2.5）g，明显高于正常对照组（18.3±2.7）g（P＜0.01）（图2F）。

2.2 孕期暴露纳米银对子代成年雌性小鼠乳腺淋巴结面积和乳腺导管增生的影响

洋红-硫酸铝钾染色结果显示（图3A～3C），正常对照组子代小鼠乳腺导管具有清晰的二级结构和三级分支结构（图3A），Ag-NP染毒组子代小鼠乳腺导管的分支结构明显发生异常，导管明显变细，而且发生了显著的紊乱（图3B）；乳腺组织中含有淋巴结；淋巴结面积定量结果显示，Ag-NP染毒组子代成年雌性小鼠乳腺淋巴结面积与正常对照组无显著差异〔（150 026±111 397）μm2vs（1381 621±168 670）μm2，n=5，P=0.24〕。HE染色结果显示（图3D～3F），正常对照组子代小鼠腺导管具有清晰的双层细胞结构（图3D），Ag-NP染毒组子代小鼠乳腺细胞层数变多，导管发生增生（图3E）；Ag-NP染毒组子代小鼠乳腺导管增生比例显著高于正常对照组〔（54.6±2.8）%vs（35.1±8.6）%，n=5，P＜0.01〕（图3F）。

Fig.2 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on uterus diameter and uterus length，survival rate and body mass of offspring female adult mice.Mice at at the 12thday of pregnancy were given ig Ag-NPs suspension 5 mg·kg-1for 7 d，and female offspring mice were chosen for index detection.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

Fig.3 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on lymph node area（A-C）and mammary ductal hyperplasia（D-F）of offspring female adult mice by magenta aluminum potassium sulfate staining and HE staining，respectively.See Fig.2 for the mouse treatment.Yellow arrow represents the lymph node，red arrow the proliferating duct，and black arrow the normal duct.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control group.

2.3 孕期纳米银暴露对子代成年雌性小鼠乳腺管腔干细胞亚群的影响

流式分选结果显示（图4A～4F），与正常对照组相比，Ag-NP染毒组子代成年雌性小鼠的MRU和CFC百分比无统计学差异，L/B比值无改变。Ag-NP染毒组子代成年雌性小鼠LP为（1.1±0.2）%，显著低于正常对照组（2.7±0.7）%（P＜0.01）。

2.4 孕期纳米银暴露对子代成年雌性小鼠乳腺管腔干细胞亚群集落百分比和总集落数的影响

Fig.4 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on composition of mammary lumina stem cells of offspring female adult mice by flow cytometry.See Fig.2 for the mouse treatment.MRU：mammary repopulation unit；L/B：luminal to basal；CFC：colong forming cell；LP：luminal progenitor.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

Fig.5 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on luminal stem cell subcolony and total colony of offspring female adult mice by immunofluorescence（A，C）and Giemsa staining（B，D）.See Fig.2 for the mouse treatment.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

集落形成实验和免疫荧光实验和Giemsa染色结果显示（图5A～5D），Ag-NP染毒组的双阳性集落（K8+K14+）比例为（78.2±2.2）%，显著高于正常对照组（51.1±7.2）%（P＜0.01），而K8+单阳性比例为（9.7±1.6）%，与正常对照组（23.8±2.9）%相比明显减少（P＜0.01）（图5A，C），但总的集落数无差异（图5B，D）。

2.5 孕期纳米银暴露对子代小鼠乳腺导管中Cox-2和Stat5蛋白表达的影响

免疫组化结果显示（图6A～6D），与正常对照组相比，Ag-NP染毒组子代成年雌性小鼠乳腺导管Cox-2表达显著升高〔（0.46±0.02）vs（0.41±0.04），n=5，P＜0.05〕，Stat5表达亦显著升高〔（0.52±0.07）vs（0.65±0.04），n=5，P＜0.01〕。

Fig.6 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on protein expressions of cyclooxygenase-2（Cox-2）and signal transducer and activator of transcription 5（Stat5）of offspring female adult mice by immunohistochemistry.See Fig.2 for the mouse treatment.C and D was the semiquantative result of A and B，respectively.±s，n=5. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 讨论

本研究结果显示，母鼠在P12～P18暴露于Ag-NP后，子代成年雌性小鼠子宫形态没有发生变化。MORISHITA等［23］研究发现，Ag-NP10 mg·kg-1染毒对小鼠无明显毒性；体质量为（21.00±2.00）g的昆明小鼠，Ag-NP 25 mg·kg-1给药7 d，无明显毒副作用［24］。本研究亦发现，Ag-NP 5 mg·kg-1染毒，子代小鼠子宫的长度和直径无显著改变，说明此剂量对子代小鼠的子宫无明显毒性作用。HE染色结果发现，子代小鼠乳腺增生导管的比例明显增多；乳腺整体染色结果显示，小鼠乳腺导管变细，导管走向紊乱。有研究发现，乳腺导管密度、分支结构、主导管宽度和病理学结构的异常变化是乳腺病变发展过程中的重要危险参考因素［26］。

本研究发现，孕期暴露Ag-NP后，子代成年雌性小鼠的乳腺管腔祖细胞频率降低，说明孕期暴露Ag-NP后会影响子代成年小鼠管腔干细胞群。有研究报道，管腔干细胞的形成与Stat5表达有关［27-28］。在集落的形成实验中，本研究发现，Ag-NP染毒组集落总数虽未发生明显变化，但它们不同集落的比例发生了改变。在这些集落中，K8+K14+双阳性的比例明显增多，K8+单阳性的比例明显减少，而且K14+单阳性的比例无变化，说明Ag-NP可影响细胞的分化能力，可能会使不同的细胞群之间发生转化。本研究中Cox-2和Stat5的表达在小鼠乳腺组织中均有不同程度升高，而子代小鼠淋巴结形态和其面积统计分析无显著差异，表明无明显炎症反应发生。既往研究发现，Cox-2过表达可增加乳腺癌细胞的迁移、侵袭和增殖，增加癌症干细胞样细胞；人乳腺癌肿瘤组织原位免疫染色显示，Cox-2与癌症干细胞样细胞标志物共定位，支持Cox-2诱导癌症干细胞样细胞［29］。而Stat5过表达会导致小鼠上皮增生、导管增生和ER+/PR+腺癌发生，且肿瘤中含有少量的CD44+细胞，可能为肿瘤干细胞［30］。RADLER等［31］发现，Cox-2和Stat5均能通过PI3K/Akt促进乳腺癌的进程。

综上所述，Ag-NP可能通过激活Stat5信号通路，促进炎症反应标志物Cox-2表达增加，从而影响乳腺干细胞的功能，引起乳腺导管结构改变，增加乳腺癌的发生风险。