孟 涛，宋佳阳，杨 墨，尉杰忠，段化伟

（1.山西大同大学医学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学附属第一医院，山西 大同 037006；3.中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050）

炭黑不仅是居民日常生活重要的细颗粒物污染源，而且职业暴露也较为广泛。目前，国外研究者已将炭黑浓度纳入大气细颗粒物的监测体系［1］，其所致的健康风险、及其与疾病的关系一直是环境与健康领域研究的热点。研究证实，细颗粒物暴露与呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化和肺癌等呼吸系统疾病的发生密切相关［2-4］，且认为细颗粒物的毒性效应主要与其含有的有机物和重金属组分有关，而未考虑碳核的毒性效应。课题组前期研究发现，持续吸入单纯炭黑，尤其是纳米级炭黑可造成小鼠肺组织损伤［5-7］。尽管炭黑颗粒所致肺毒性机制尚不明确，但研究证实其损伤机制主要与氧化应激反应有关［7-9］。

当机体暴露于污染物时，会导致氧化损伤，同时也会启动防御机制，通过上调抗氧化系统，以缓解细胞氧化损伤，该反应是由抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）所调控。核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）与ARE结合后，调控亚铁血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、NAD（P）H醌氧化还原酶1〔NAD（P）H quinone oxidoreductase-1，NQO-1〕和谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）等Ⅱ相抗氧化酶基因的转录。因此，Nrf2/ARE通路是重要的抗氧化防御通路，其调控的抗氧化酶是污染物暴露和肺癌防治的重要标志物和治疗靶点［10］。以往研究侧重评估细颗粒物的全组分及有机提取物急性暴露后Nrf2/ARE调控的Ⅱ相抗氧化酶的变化［11-13］，但并未探讨其核心组分碳核与Nrf2防御系统的关系。目前，关于单纯炭黑暴露与Nrf2/ARE通路关系的报道较少，早期发现用炭黑处理人肺上皮细胞BEAS-2B后未诱导HO-1表达［14］，然而持续吸入炭黑是否会影响机体的Nrf2/ARE抗氧化防御系统尚不清楚。

为此，本研究选取高纯度乙炔炭黑，建立炭黑气溶胶全身吸入染毒小鼠模型，观察肺组织的病理结构变化，评估肺组织的损伤情况；检测肺组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，探讨炭黑对肺组织氧化应激水平的影响；测定肺组织Nrf2及抗氧化酶HO-1，NQO-1和GCLC变化，分析炭黑对Nrf2氧化防御系统的影响。探讨吸入炭黑气溶胶对肺组织氧化和抗氧化系统的影响，为炭黑所致肺损伤的毒性机制和防治药物研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

炭黑颗粒（焦作市和兴化学工业有限公司，纯度＞99.8%，呈球形，分散均匀，单颗粒尺寸30～50 nm，团聚颗粒尺寸200～400nm，比表面积74.85m2·g-1［5］）。ROS，SOD，GSH-Px，CAT和MDA检测试剂盒、细胞核蛋白和细胞质蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA强裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）（碧云天生物技术公司）；Trizol、SDS-PAGE预制胶、蛋白标准品、紫外分光光度计及蛋白电泳和印迹系统（美国Life公司）；PCR引物合成（上海英俊生物技术公司）；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒（美国Promega公司）；兔抗小鼠Nrf2、HO-1、NQO-1、GCLC、β肌动蛋白和组蛋白H1多克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（美国Abcam公司）；底物化学发光试剂盒（美国CST公司）；其余试剂均为国产生化试剂。气溶胶发生装置、动式全身吸入染毒装置和质量浓度监测器（北京慧荣和科技发展有限公司）；颗粒粒径分析仪（美国TSI公司）；酶标仪（美国Bio-Tek公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；低温离心机（美国Sigma公司）；实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；化学发光分析仪（北京原平皓生物技术有限公司）；切片机（德国Leica公司）；光学显微镜（日本Nikon公司）；透射电子显微镜（日本电子株式会社）；X射线能谱仪（英国Oxford公司）。

1.2 动物

8周龄健康SPF级雄性C57BL/6小鼠30只（北京斯贝福实验动物科技有限公司），合格证号：SCXK（京）2019-0010，体质量20～25 g。在SPF级动物房内适应7 d，饲养温度22～26℃，湿度45%～55%，保持12 h光照。除吸入染毒外，不限制动物活动和进食饮水，且实验操作遵循实验动物的管理条例。

1.3 吸入染毒模型的建立和实验分组

将炭黑烘烤后加入气溶胶发生装置，并与全身吸入柜相连接。依据炭黑职业人群暴露浓度［15］，设定炭黑气溶胶浓度（15和30 mg·m-3），待浓度稳定后将小鼠置吸入柜内，每天染毒6 h，连续染毒14 d，利用滤膜称重法动态测定吸入柜中炭黑气溶胶浓度分别为15.06±2.15和（29.61±3.40）mg·m-3。粒径分析仪监测吸入柜内炭黑的粒径分布，其中粒径＜100 nm的颗粒占15.00%，＜400 nm的颗粒占81.68%。正常对照组小鼠以同样暴露方式给予过滤空气。每组共10只小鼠，末次染毒后，将小鼠麻醉后处死，取肺组织，分别用于组织病理检查（n=3）和电镜检查（n=1）和氧化应激指标、mRNA和蛋白表达的测定（n=6）。

1.4 HE染色和电镜检测肺组织病理变化及X射线能谱仪分析肺组织微区元素

小鼠麻醉后，行全身灌注和固定，解剖取肺，制备石蜡切片，行HE染色后光镜下观察肺组织学改变，每张切片观察10个视野，依据毛细血管充血、中性粒细胞渗出、支气管纤毛及上皮损伤、肺间隔增宽、肺泡腔内纤维蛋白渗出等5项指标进行0～4半定量评分，并计算总分。制备1 mm3肺组织切块，于4℃保存和固定，经漂洗、固定、染色、脱水、切片及再染色，透射电镜观察肺超微组织结构。采用透射电镜选取肺组织颗粒沉积区域作为目标微区，由于各种元素具有X射线的特征性波长，通过X射线能谱仪对目标区域进行元素种类及含量分析。

1.5 化学荧光法检测肺组织单细胞ROS含量

各组取同一部位肺组织30 mg，冰浴条件下制备肺组织单细胞悬液，用荧光探针DCFH-DA 37℃孵育20 min，PBS洗3次后重悬，实验设不加探针的平行管。流式细胞仪测定肺组织单细胞悬液中ROS水平。

1.6 ELISA法检测肺组织SOD，GSH-Px和CAT活性及MDA含量

取约30 mg肺组织，制备10%组织匀浆液，按照试剂盒说明，用酶标仪分别检测抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的活性及MDA的含量。

1.7 荧光定量PCR法检测肺组织Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC mRNA表达水平

取约30 mg肺组织，Trizol法提取肺组织总RNA，用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，OD 260/280比值在1.8～2.0之间。用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，在QS12K荧光定量PCR系统下，扩增目的基因（Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC）和内参基因β肌动蛋白。引物序列详见表1，并用2-ΔΔCT法计算各目的基因的表达量。

1.8 Western印迹法检测肺组织Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC蛋白表达水平

取20 mg新鲜肺组织，按照试剂说明抽提同一样品的胞核和胞质蛋白，检测细胞不同部位Nrf2的表达。取30 mg冻存肺组织，加入RIPA裂解液（含1 mmol·L-1PMSF），冰上充分研磨和静置，4℃、14 000×g离心10 min，取上清后用BCA法测定蛋白浓度，高温变性后-20℃保存。使用Life预制胶，加样10 mg后经垂直电泳及恒压转膜，将PVDF膜用5%脱脂奶粉37℃封闭2 h。加入一抗HO-1 为1∶2000，Nrf2，NQO-1 和GCLC 均为 1∶1000，并以组蛋白H1和β肌动蛋白（均为1∶1000）分别作为胞核和胞质蛋白的内参，4℃孵育过夜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶20 000），37℃孵育1 h，使用底物化学发光试剂盒显色，并采用化学发光仪读取和拍照，用Image J软件分析，以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度的比值表示目标蛋白的表达量。

1.9 统计学分析

应用SPSS20.0软件分析数据，各组数据均符合正态分布，且满足方差齐性结果，以±s表示。3组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，相关性用Pearson分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 炭黑对小鼠肺组织病理结构的影响

如图1A所示，小鼠连续14 d吸入炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-3后，肺组织颜色变黑、质地变硬，29.61 mg·m-3组肺组织变化更为显著。图1B所示，正常对照组小鼠肺泡和细支气管壁结构完整，管腔内无渗出物；炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-3组肺泡和细支气管壁结构紊乱，肺间隔、肺泡及细支气管腔内出现少至多量黑色颗粒及吞噬颗粒的巨噬细胞，并出现毛细血管充血、炎细胞浸润、肺泡和支气管上皮和纤毛受损、及肺间隔增厚等病理变化。图1C所示，正常对照组小鼠肺巨噬细胞中各细胞器结构完整，仅见少量初级溶酶体，而炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-3组肺巨噬细胞含有大量初级和次级溶酶体，线粒体肿胀且嵴被破坏，胞质含空泡和自噬体，胞膜、胞质及溶酶体内可见较多黑色颗粒。通过X射线电子能谱分析结果表明，颗粒沉积微区的元素组成为碳、氧、铅、氮，其中碳含量为（90±4）%，证实黑色颗粒成分主要为碳元素，即为炭黑颗粒。

炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-3组小鼠肺损伤评分分别为5.62±1.13和7.63±1.26，显著高于正常对照组1.90±0.26（P＜0.01），且29.61 mg·m-3组肺组织损伤程度比15.06 mg·m-3组更为严重（P＜0.05）。

2.2 炭黑对小鼠肺组织氧化应激指标的影响

由图2A～E可见，与正常对照组〔细胞内ROS平均荧光强度：226±51.4；SOD：（4.5±0.8）kU·g-1；GSH-Px：（108±19.2）kU·g-1；CAT：（9.1±1.5）kU·g-1；MDA：（13.4±2.8）μmol·g-1〕相比，吸入炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-314 d后，小鼠肺组织单细胞内ROS含量分别上升至455±120和526±98.2（P＜0.01），SOD活性分别下降至（3.5±0.9）和（3.2±0.8）kU·g-1，GSH-Px活性分别下降至（89.0±14.5）和（84.3±10.4）kU·g-1，CAT活性分别下降至（7.5±1.2）和（7.1±1.0）kU·g-1，MDA含量分别上升至（16.8±2.1）和（17.3±2.0）μmol·g-1（P＜0.05）。与15.06 mg·m-3组相比，29.61 mg·m-3组 SOD，GSH-Px和CAT活性有下降趋势，细胞内ROS和肺组织MDA含量有升高趋势，但无显著差异。

Fig.1 Effect of carbon black（CB）aerosol exposure on histopathology and ultrastructure of lung tissue in mice.The mice were exposed to CB aerosols（15.06 and 29.61 mg·m-3）orfiltered air for 6 h per day for a continuous inhalation of 14 d.A：images of lung tissue；B：histopathology of lung tissue by HE staining；C：ultrastructure of lung tissue by transmission electron microscope examination.The red arrows indicate the CB particles in lung tissue and the green arrows indicate the lung macrophage.

Fig.2 Effect of CB aerosol exposure on intracellular reactive oxygen species（ROS，A）content，superoxide dismutase（SOD，B），glutathione peroxidase（GSH-Px，C），catalase（CAT，D）activities，and malondialdehyde（MDA，E）content of lung tissue in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 炭黑对小鼠肺组织Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC mRNA表达的影响

如图3所示，与正常对照组相比，炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-3组肺组织Nrf2 mRNA表达分别为（99±19）%和（110±21）%，无显著差异；HO-1，NQO-1和GCLC mRNA表达水平分别显著上调至（190±47）%和（235±68）%（P＜0.01）、（151±34）%和（168±28）%（P＜0.05）、以及（143±25）%和（193±46）%（P＜0.05）；且炭黑气溶胶 29.61 mg·m-3组GCLC mRNA表达上调比15.06 mg·m-3组更为明显（P＜0.05）。Pearson相关性分析显示，HO-1，NQO-1和GCLCmRNA水平与ROS水平呈显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.785，0.699和0.720。

Fig.3 Effect of CB aerosol exposure on mRNA levels of Nrf2，HO-1，NQO-1 and GCLC of lung tissue in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=6. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with CB 15.06 mg·m-3group.

2.4 炭黑对小鼠肺组织Nrf2，HO-1，NQO-1和GCLC蛋白表达的影响

如图4所示，与正常对照组相比〔HO-1：（102±6）%；NQO-1：（98±4）%；GCLC：（102±8）%〕，炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-3组肺组织中Nrf2调控的抗氧化酶蛋白表达水平显著上调（P＜0.05），其中HO-1分别上调至（136±13）%和（165±12）%，NQO-1分别上调至（118±8）%和（126±10）%，GCLC分别上调至（130±11）%和（145±18）%。尽管肺组织Nrf2蛋白总体表达水平未见显著变化，但胞质Nrf2水平明显降低（P＜0.05）而胞核Nrf2水平明显增加（P＜0.01）。与正常对照组相比〔胞质Nrf2：（95±8）%；胞核Nrf2：（109±12）%〕，炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-3组肺组织胞质Nrf2下调至（74±12）%和（37±22）%，而胞核Nrf2上调至（251±36）%和（315±46）%。此外，HO-1及胞质和胞核中Nrf2蛋白水平在不同剂量组间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of CB aerosol exposure on protein levels of Nrf2，HO-1，NQO-1 and GCLC of lung tissue in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.D was the semiquantitative result of A-C.x ± s，n=6. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with CB 15.06 mg·m-3group.

3 讨论

本研究结果表明，吸入炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-314 d后，肺组织细胞内可见炭黑颗粒和吞噬炭黑颗粒的巨噬细胞，由于持续吸入造成沉积于肺组织的炭黑数量较多，远超过巨噬细胞的清除能力，这些未被吞噬的颗粒和活化的巨噬细胞造成肺组织毛细血管充血、中性粒细胞浸润、上皮及纤毛的破坏、肺间隔增厚等多种损伤性变化。

体外和体内研究表明，炭黑颗粒所致机体的生物学效应主要是由氧化应激所触发，即氧化应激是引起炭黑颗粒所致肺损伤的早期关键生物学事件［7-9］。过去研究更多关注急性或短期接触炭黑颗粒物后机体氧化与抗氧化水平的失衡，且绝大多数动物模型采用气管滴注造模，而本研究利用动式吸入模型，反复吸入炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-314 d后，对肺组织造成不同程度地氧化损伤，表现为细胞内ROS水平升高，肺组织SOD，GSH-Px和CAT活性下降，表明连续吸入炭黑气溶胶可导致肺组织抗氧化能力下降，打破机体的氧化和抗氧化平衡，诱导持续的氧化应激反应，并加剧ROS对细胞内生物大分子的氧化损伤，本次研究也证实，持续吸入炭黑后肺组织的氧化产物MDA水平增加。

然而，以往研究重点关注炭黑颗粒所致机体的氧化应激与氧化损伤，并未探讨持续接触炭黑后机体氧化防御系统的变化、以及与暴露的关系。颗粒物暴露后先触发氧化应激，随之启动抗氧化防御系统，保护细胞免受氧化损伤，其中Nrf2/ARE通路是机体极为重要的氧化防御通路［16］。前期研究证实，细颗粒全组分及其有机提取物可影响小鼠肺组织Nrf2及抗氧化酶的表达［11-13］，但并未明确核心碳核与氧化防御的关系。本研究利用吸入染毒模型探讨炭黑持续暴露后小鼠肺组织Nrf2及其抗氧酶的变化，并分析这些变化与暴露剂量的关系。实验结果证实，持续吸入炭黑气溶胶会促使Nrf2从胞质转位到胞核，上调Ⅱ相抗氧化酶HO-1，NQO-1和GCLC mRNA和蛋白表达，且随着暴露剂量增加抗氧化酶上调水平更为显著，说明持续暴露炭黑14 d后可激活机体的Nrf2氧化防御系统。但也有体外研究证实，用炭黑处理人肺上皮细胞后，HO-1表达水平无显著变化［14］。这一结果的差异可能与研究对象、炭黑粒径、暴露剂量、暴露时间和暴露方式等有关。

ROS是调节氧化防御通路中重要的第二信使，其中Nrf2在ROS的调节下可以被迅速活化。正常情况下，Nrf2存在于胞质中，与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）耦联形成Keap1-Nrf2复合物，阻止Nrf2向核内转位。当细胞受到颗粒物刺激后，ROS氧化Keap1活性位点，改变Keap1构象，使Keap1-Nrf2发生解离，随之游离Nrf2被转到核内，与ARE元件结合，调控多种抗氧化酶的表达，而这些酶是氧化防御的重要标志物［17］。本研究证实，吸入炭黑气溶胶后诱导肺组织单细胞ROS水平显著增加，且ROS水平与HO-1，NQO-1和GCLC mRNA水平显著正相关，但并未证实ROS和Nrf2调控的关系，后续将利用体外模型探讨Nrf2的上游调控机制。尽管Nrf2的mRNA和蛋白总体水平未见显著变化，但胞核Nrf2水平增加，而胞质Nrf2水平降低，提示活化的Nrf2水平增加，并上调Ⅱ相抗氧化酶的表达。此外，本研究仅观察炭黑气溶胶吸入14 d小鼠肺组织抗氧化防御系统的变化，后续将重点关注炭黑暴露后Nrf2及其抗氧化酶的时间依赖性变化。

综上所述，连续吸入炭黑气溶胶15.06和29.61 mg·m-314 d后，小鼠肺组织和细胞内出现炭黑颗粒，造成肺组织氧化应激，并激活抗氧化防御系统，使Nrf2从胞质转位进入胞核，激发Nrf2的活性，上调抗氧化酶HO-1，NQO-1和GCLC表达。本研究结果为炭黑颗粒所致肺疾病的防治提供新思路和治疗靶点，并为解析细颗粒物不同组分的健康危害及防治提供实验依据。