白晶晶，吴婵媛，钟丹丽，王迁，曾小峰

系统生物学从生命整体层面研究生物分子间的相互作用对生物体功能的影响，其兴起得益于组学分析方法以及生物信息学的发展。有别于仅能提供有限的目的分子以及通路信息的传统分子生物学和生理学技术，组学技术可以对生物系统进行全面而整体的描述。1998年Oliver等[1]通过检测酵母部分基因缺失而导致的转录组、蛋白质组以及代谢组三个层面的相对变化，对酿酒酵母的基因组进行了系统的功能分析,首次提出代谢组的概念，即一个有机体所表达的全部代谢分子的集合。2001年Fiehn[2]将代谢组学定义为对所研究的生物系统包含的代谢分子进行全面而定量的分析。脂质组学是代谢组学的一个分支，研究在不同状态下患者的脂质代谢以及由脂质介导的对细胞稳态具有调节功能的信号过程。代谢组学的分析类型包括非靶向与靶向代谢组学分析，核磁共振与质谱技术是代谢组学的主要技术平台。

2005年加拿大基因组委会投资开展“人类代谢组计划”，旨在通过促进代谢组学的研究改善疾病的诊断、预后以及监测；提升对药物代谢与毒理的深入认识；实现基因组与代谢组的整合以及加快代谢组学相关软件的开发。目前，人类代谢组数据库(human metabolome database, HMDB)包含114 100种代谢分子、25 770个代谢通路、5 498种与疾病相关的化合物以及3 056种与单个核苷酸多态性位点相关的代谢物等[3]。现阶段与人类疾病相关的代谢组学研究主要集中在肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、肝脏以及肾脏疾病[4]。本文主要从代谢组学的工作流程、代谢组学在风湿性疾病中的应用以及对未来的展望三个方面进行综述。

1 代谢组学的工作流程

代谢组学的工作流程包括生物学问题的提出、样本收集与预处理、数据采集以及数据分析。提出明确清晰的生物学问题是代谢组学研究的首要步骤，其决定了研究采用的技术平台、分析方法(靶向与非靶向代谢组学研究)、样本类型(生物液体、组织、细胞等)、样本数量以及实验条件等的选取。代谢组学研究需要完整并严格的实验设计，包括合适的样本数量、规范一致的样本收集与储存过程以及匹配的对照样本等。

样本收集后需要进行预处理。目前代谢组学研究尚没有一种普遍适用的标准化预处理方案，不同的方案会产生不同的分析结果，预处理方案的优化则可有效提高鉴定的代谢分子数量，基本原则是尽可能客观地保留并反映样本中的代谢信息[5]。

样本收集与预处理完成后，需要选取合适的分析技术进行数据采集，由于样本化学组分的理化性质差异较大，至今尚无单一技术可以实现对样本进行充分的分离和鉴定，目前多采用联用技术，比如色谱-质谱联用技术兼有色谱的高分离度与质谱的高灵敏度的特性，广泛应用于临床代谢组学的研究。对于采集到的元数据进行滤噪、峰对齐、峰匹配、标准化和归一化等预处理后，常用非监督与监督方法对样本进行分析。偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)是目前广泛采用的监督分析方法。对非靶向代谢组学研究得到的差异代谢分子的鉴定与功能注释需要依靠数据库检索，常用的开源数据库包括HMDM[3]、KEGG[6]、PubChem[7]、Metlin[8]以及MassBank[9]等。

2 代谢组学在风湿性疾病中的应用

2.1 生物标记物筛选

2.1.1 系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮(systematic lupus erythemato-sus, SLE)是一种伴有多器官损害的自身免疫性疾病，多种致病机制参与，引起免疫耐受受损与器官功能异常[10]。Yan等[11]人对比80例SLE患者与57例性别年龄匹配的健康对照的血清代谢谱，发现SLE患者血清中多种氨基酸、碳水化合物、脂肪酸、延胡索酸、氨基丙二酸、苏糖酸以及α-生育酚等代谢分子水平下降；甲硫氨酸、谷氨酸、胱氨酸、1-单棕榈酸甘油酯以及2-羟基异丁酸甲酯等水平上升。差异代谢分子主要富集的代谢通路包括蛋白质的合成、氨循环、天冬氨酸代谢与半乳糖代谢等。活动期的SLE患者血清谷氨酸与2-羟基异丁酸水平升高而柠檬酸盐、亚油酸以及对羟基苯甲酸丙酯水平下降。Wu等[12]发现SLE患者的糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸β氧化以及氨基酸代谢异常，间接导致能量的生物合成下降，并发现SLE患者血清中的脂质过氧化产物13-羟基-十八碳二烯酸与9-羟基-十八碳二烯酸水平升高，抗氧化剂谷胱甘肽水平下降，代谢组表现出显著的脂质过氧化，反映SLE患者存在氧化应激损伤。

2.1.2 类风湿关节炎

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性对称性多关节炎，晚期因软骨与骨侵蚀造成关节破坏。早期诊断与早期规范化治疗对于降低RA患者多种并发症，延长患者生存时间至关重要。Yousri等[13]对132例RA患者的血浆代谢组进行分析，发现32种与RA相关的代谢分子，包括已经报道的脱氢表雄酮硫酸盐、皮质醇、雄烯二酮等，并扩展到类固醇代谢途径中其他代谢分子。利用代谢谱进行RA分类的敏感度为91%特异度为88%。Dubey等[14]利用核磁共振技术，分析RA患者与自身反应性关节炎(Reactive arthritis, ReA)患者血清代谢分子差异，构建了用于鉴别ReA与RA的代谢分子模型。生物制剂的应用对RA患者的管理产生了革命性的改变，然而约30%～40%的患者对生物制剂的反应不佳[15]。Takahashi等[16]前瞻性地招募了43例病情活动的RA患者并利用毛细管电泳飞行质谱分析患者的血清代谢谱，随后26例患者给予肿瘤坏死因子抑制剂(Tumor Necrosis Factor inhibitor, TNF i)，17例患者给予阿巴西普(Abatacept, ABT)治疗，12周后评估发现14例TNFi组与11例ABT组患者DAS28-CRP显著下降，对比反应不佳患者的代谢谱，TNFi组与ABT组分别鉴定出五种与三种差异的关键代谢物，可用于预测RA患者对于治疗的反应。

2.1.3 骨关节炎

骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是关节炎中最为常见的类型，约10%的60岁及以上的世界人口患有症状性OA[17]。Zheng等[18]在OA患者的关节滑液中发现6种差异代谢分子，并经靶向代谢组学证实前三种代谢物，包括谷氨酰胺、1,5-脱水葡萄糖醇以及葡萄糖内酯，组合可显著区分OA患者与健康人群，单一分子葡萄糖内酯则可有效区分OA与RA患者。Jonasdottir等[19]在OA与RA患者的关节滑液中检测到37种脂质分子，包括多不饱和脂肪酸以及与促炎相关的脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)与环氧合酶(cyclooxygenase, COX)通路的代谢分子，如前列腺素E2以及血栓烷B2等，代谢分子与其前体分子的比率表明OA患者的5-LOX与15-LOX活性相比RA患者低，而COX来源的代谢分子则没有差别，体外实验进一步发现滑膜组织细胞与关节滑液中的炎性细胞可能是5-LOX与15-LOX代谢产物的来源。

2.1.4 其他风湿性疾病

白塞病(Behçet’s disease, BD)是一种多系统累及的血管炎性疾病，因缺乏特异性的血清学标志物，早期诊断与早期治疗相对困难。Zheng等[20]研究发现BD患者血清磷脂酰胆碱水平降低，多种不饱和脂肪酸水平升高，其中，血清亚油酸与花生四烯酸在BD患者治疗缓解后显著降低，并经验证队列证实，BD患者血清亚油酸与花生四烯酸较疾病对照患者显著升高，受试者工作特征显示较高的灵敏度与特异度，有望成为BD患者的诊断标志物。

大动脉炎(takayasu arteritis, TA)是一种隐匿的慢性疾病，通常在临床上首先表现为不可逆的血管狭窄。Jain等[21]研究发现谷氨酸与N-乙酰糖蛋白对病情活动组与稳定组的TA患者有较好的区分度，长期随访发现，活动组TA患者在病情治疗稳定后代谢特征发生改变，稳定组TA患者经免疫抑制剂治疗与未经免疫抑制剂治疗的血清代谢谱差异不明显，但仍需较大的纵向TA患者队列进行验证。

原发性干燥综合征(primary Sjögren’s syndrome, pSS)是一种以唾液腺与泪腺功能低下为主要特征的自身免疫性疾病。Kageyama等[22]检测pSS患者与健康人群唾液中的代谢分子，发现pSS患者唾液代谢物多样性降低，部分代谢物分子的种类下降可能与慢性唾液腺炎导致的唾液腺破坏有关。

多发性肌炎(polymyositis, PM)与皮肌炎(dermatomyositis, DM)是以骨骼肌无力为主要表现的慢性自身免疫性疾病。Raouf等[23]发现PM/DM患者的血清脂质谱的脂肪酸结构发生异常，棕榈酸水平显著高于健康对照，而花生四烯酸的水平则显著降低。总体来讲，饱和脂肪酸水平升高而二十二碳六烯酸水平下降，不饱和脂肪酸水平没有显著差异。患者血清肌酸激酶与几种脂质分子的水平之间的相关性表明脂质变化可能与肌肉的运动功能异常有关。

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是一种主要累及中轴骨的慢性炎症性关节炎。Wang等[24]分析AS患者尿液、血浆以及韧带组织的代谢谱并筛选出20种相关的代谢分子组合，可作为AS患者的潜在生物标记物，通过KEGG分析发现代谢物与脂肪代谢、肠道微生物代谢、糖代谢以及胆碱代谢通路相关，并可能参与免疫调节。

2.1.5 风湿性疾病相关内脏并发症

风湿性疾病常并发多器官累及，影响患者的远期预后[25]。Guleria等[26]研究发现相比未合并肾炎的SLE患者，狼疮肾炎患者血清的脂类代谢分子包括低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、不饱和脂肪酸与甘油三酯水平升高而醋酸盐的水平下降。经过6个月的治疗，升高的脂类分子水平显著下降，醋酸盐的水平上升，并与SLEDAI和血清中补体水平具有显著的相关性，狼疮肾炎患者经过免疫抑制剂治疗后血清代谢组发生重塑，可用于监测患者对于治疗方案的反应[27]。

RA患者可出现急性起病的弥漫性间质性肺疾病(acute-onset diffuse interstitial lung disease, AoDILD)，Furukawa等[28]分析10例伴发AoDILD的RA患者发病与稳定期的血清代谢组，发现甘露糖胺、蒜氨酸、犬尿氨酸、2-羟基丁酸四种代谢物构成的PLS-DA模型可有效评估RA患者的AoDILD病情。

2.2 发病机制研究

联合其他组学技术并进行生物信息学挖掘是代谢组学突破生物标记物层面向疾病机制进行探索的必经之路。Rodgers等[29]将健康对照的外周血单核细胞置于含有RA患者关节滑液的缺氧培养体系中，利用质谱技术分析单核细胞的代谢谱发现相比单纯暴露于缺氧体系与LPS刺激的缺氧体系，置于RA患者关节滑液中的单核细胞中左旋肉碱、酰基肉碱、3-脱羟基肉碱以及O-乙酰肉碱水平升高。研究者结合RA患者外周血单核细胞与关节滑液巨噬细胞的转录组学结果，发现RA患者的外周血单核细胞浸润滑膜后，脂肪酸代谢发生改变并促进CCL20介导的炎症反应。

目前已有文献广泛报道系统性自身免疫性疾病患者肠道菌群失衡[30]，Bellocchi等[31]联合血浆代谢组学与肠道微生态组学，发现系统性自身免疫性疾病的患者的肠道菌群与代谢功能存在联系，通过饮食或者其他干预方式调整菌群可能成为解决由菌群失衡导致的系统性损害的潜在策略，同时患者血浆代谢分子变化也成为反映肠道菌群结构改变的指标。

风湿性疾病患者代谢异常不仅体现在体液代谢分子的水平异常以及肠道菌群的比例失衡等系统性的代谢紊乱，同时也包括免疫细胞内的代谢通路的异常活化比如调节细胞生长与能量利用的mTOR通路以及与炎症相关的5-LOX通路[32-33]。2011年Mathis等[34]首次提出免疫代谢的概念，即研究免疫反应与代谢过程间的相互作用。相关研究主要包括两个方面，即从生物体器官组织水平研究免疫与代谢的作用关系以及从细胞水平检测免疫细胞的代谢状态，为疾病发病机制研究提供了新的思路，并逐渐成为免疫学研究的一个重要领域。风湿性疾病代谢组学研究主要特点见表1。

表1 风湿性疾病代谢组学研究主要特点

3 展望

风湿性疾病的一个主要特征是患者血清自身抗体的产生，特异性抗体以及标记性抗体对于疾病诊断具有重要的指导意义，但是也存在阳性率不高、多数风湿性疾病目前缺乏特异性的自身抗体以及自身抗体滴度与病情相关性较低等问题，并且具有同种自身抗体的患者的临床表现仍多种多样，对于疾病表型进行精准的分子分型有赖于更多的生物标记物的发现。

代谢组学为描述风湿性疾病的代谢特征以及相关的生物标记物的筛选提供了技术支持，但是由于代谢分子的物理化学性质复杂，目前没有一个通用的分析平台和一致性的操作方案，所以不同实验室的结果存在差异。目前大部分寻找生物标记物的研究仅停留在标记物的初筛阶段，没有进行分析验证以及临床验证。利用小样本进行标志物试验性地鉴定相对容易，但是因为多种混杂因素的存在，实验结果的可重复性较低。目前风湿性疾病有文献报道的样本量大于100例的代谢组学研究主要集中在患病率较高的疾病如RA以及SLE等，但是存在分组不明确，患者资料采集不完整而导致混杂因素过多的问题，如疾病活动程度、糖皮质激素的使用剂量、患者的BMI以及采集标本时患者是否空腹等，对于代谢组学的结果解释带来困难。高质量的风湿性疾病研究队列、规范化的生物样本收集与储存流程、完备的实验室环境以及严格的代谢组学实验设计是进行代谢组学生物标记物研究的必要条件。目前，风湿性疾病相关的代谢组学研究数量不断增长，产生了大量代谢组学数据，建立风湿性疾病相关的代谢组学数据库有助于改善风湿性疾病的诊断、预后以及监测，促进对临床试验药物的代谢与毒理的深入认识并实现多组学信息的整合。

在发病机制研究方面，科学界正在积极探索代谢组学的功能特征[35-36]。免疫代谢的兴起为风湿性疾病的机制研究提供了新的方向，单细胞代谢组学以及基于质谱成像技术的空间代谢组学技术的发展将推动功能代谢组学时代的到来，促进人类从生物代谢的角度对生命与疾病进行深入的理解。