张昊泽，费允云，陈华，宣磊，张文，张奉春，张卓莉

人体正常情况下可以通过中枢免疫耐受和外周免疫耐受清除自身反应性T细胞和B细胞。遗传、环境等多种诱发因素共同作用可使自身抗原通过分子模拟、表位扩展机制暴露于抗原提呈细胞，使自身反应性淋巴细胞活化，机体免疫平衡被打破，导致自身免疫性疾病发生[1]。

原发性干燥综合征(primary Sjöjren’s syndrome，pSS)就是这样一类以B细胞高度活化为特征的疾病，大量B细胞、浆细胞浸润至腺体造成不可逆性损伤，5%～10% pSS患者可以进展为淋巴瘤[2]。近些年开展的有关B细胞清除靶向药物以及B细胞活化因子抑制剂的临床试验表明，这些药物可降低pSS患者疾病活动度，改善口眼干等主观症状，减少激素用量[3-4]。推测这些药物可通过有效清除高度活化的自身反应性B细胞，阻断其恶性循环扩增，使得正常的B细胞亚群得以重塑，免疫系统的稳态得以重建[5-6]。因此，研究pSS患者B细胞增殖、分化、活化过程具有重要意义。

B细胞识别抗原的关键部位是B细胞受体(B cell receptor，BCR)，BCR在B细胞成熟发育的过程中先后经历Ig基因重排、轻重链组合、体细胞高频突变、Ig类别转换等过程，可以形成1013以上具有独特抗原特异性的抗体分子，并且可以通过抗原受体编辑和受体修正清除自身反应性B细胞克隆，最终形成庞大的B细胞受体库[7]。BCR 是由两条重链(H链)与两条轻链组成的四聚体，其可变区和恒定区分别由不同染色体上的多个不连续基因片段重排所编码。人的H 链(14q32.33)由“Vn-Dn-Jn-Cn”基因重排形成，其可变区包含三个高变区，分别为CDR1、CDR2、CDR3，决定B细胞识别抗原肽的关键部位是最具多样性的重链 CDR3区，由IGHV(51个功能性基因片段)、IGHD(23个功能性基因片段)和IGHJ(6个功能性基因片段)通过基因重排以及基因连接过程中插入或剪接的核苷酸序列组成。每种克隆B细胞的BCR有着特定的互补决定区(complementary-determining region, CDR)，其中B细胞的CDR3是B细胞识别抗原的主要部位，其长度和多样性等都会影响其对抗原的识别与亲和力。检测B细胞CDR3受体库，能够分析生理和病理状态下机体免疫状况以及B细胞的发生、发展特点[8]。

pSS患者B细胞高度活化和大量自身抗体的产生提示参与自身抗原识别关键部位的BCR CDR3区起着重要的作用。这些pSS患者机体BCR CDR3受体库的组成、多样性、各功能基因亚家族的偏向取用可能和健康人群存在差异。既往传统的BCR检测方法包括聚合酶链-单链构象多态性分析、免疫谱型分析、核酸杂交技术、流式细胞术等，但这些技术只能粗略地对BCR序列进行分析，所获数据信息较为局限[9]。BCR CDR3受体库由海量数据组成，高通量测序技术可以高效、快速、自动化地完成基因水平分析，为BCR CDR3受体库的建立提供有力的平台保障[10]。本研究利用高通量测序技术对患者和健康人B细胞的BCR CDR3受体库进行测序和比对分析，以期初步解读pSS患者BCR CDR3序列特点，探索其在pSS发病过程中的意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究入组2014年10月至2016年2月在北京协和医院风湿免疫科及中医科门诊就诊初治pSS患者共20例，同时入组年龄性别匹配的健康志愿者(healthy controls, HC)19例。所有入组的pSS患者均符合2002年欧美共识小组(AECG)干燥综合征国际分类标准[11]和2012年美国风湿病学协会(ACR)干燥综合征诊断标准[12]，并且排除其他自身免疫性疾病、肿瘤及病毒感染。本研究经北京协和医院伦理委员会审批通过，所有入组患者及健康志愿者均签署知情同意书。

1.2 免疫磁珠分选B细胞及提取基因组DNA

留取外周静脉全血10 mL，利用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离PBMC。之后利用免疫磁珠分选B细胞(B Cell Isolation Kit Ⅱ，德国MiltenyiBiotec公司)。将获取的CD19+B细胞加入细胞裂解液中，利用血液基因组DNA提取试剂盒(北京TIANGEN生物技术有限公司)提取基因组DNA，并利用Nanodrop紫外光光度计进行质控检测。

1.3 多重PCR扩增

取质控合格的样品，配制多重PCR反应体系(QIAquick PCR Purification Kit，德国QIAGEN公司)；1.0倍XP磁珠纯化：将PCR反应混合物转移至1个1.5 mL EP管中，用AMPure XP DNA Purification kit(SPRI beads)纯化扩增后的样品，实验过程按照所用试剂说明书操作；PCR扩增目的产物，并引入测序引物：将上一步得到的DNA在200 μL的PCR管按以下体系配制PCR反应体系；1.0倍XP磁珠纯化：将PCR反应混合物转移至1个1.5 mL EP管中，用AMPure XP DNA Purification kit(SPRI beads)纯化扩增后的样品。

1.4 2%琼脂糖凝胶回收

配置2%的回收胶；将多重PCR产物进行电泳，400 mA，100 V，电泳 2 h；EB染胶；片段选择：250～350 bp；QIAGEN Gel Extraction kit回收切胶：回溶26 μL；Qiubit BR检测。

1.5 文库质控及生物信息学分析

按照仪器操作说明操作上机测序，读取数据。提取的39例样本B细胞DNA基因组条带基本完整，A260/280、A260/230均在正常范围内。过滤测序背景，将所得clean reads数据生物信息学分析采用MIXCR(http://www.nature.com/nmeth/journal/v12/n5/full/nmeth.3364.html)软件分析识别CDR3序列，再将识别的序列进行统计比较。与 IMGT 免疫细胞受体库的V/D/J 基因比对，搜索相应的基因片段，统计分析VDJ基因频率，克隆频率分布，多肽序列数目等信息。

1.6 统计学分析

应用SPSSl9.0进行统计学分析，数据以(均数±标准差)表示。计量资料首先用Kolmogorov-Smimov法检验正态性，正态分布资料两组间均数采用独立样本t检验，非正态分布资料两组间比较采用两Manne WhitneyU检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 pSS患者一般资料

入组20例pSS患者均为女性，年龄23～59岁，平均病程24(6±60)月。15例(75%)有眼干症状，18例(90%)有口干症状；17例(89.5%)出现血IgG升高，平均为(21.9±6.2)g/L；14例(80%)出现ESR增快，为(29.9±15.5)mm/h；12例进行ANA谱检测的患者中，ANA及抗SSA抗体均为阳性，抗SSB抗体阳性7例(58.3%)。

2.2 样本DNA质量检测及测序分析

通过对每一例样本B细胞进行CDR3测序建库，并进行基因重排分析(V/J分型)，通过3D展示图，可以初步看到该例pSS患者的免疫组库多样性低于HC，但在某些CDR3序列出现的频次高于HC(图1)。

图1 CDR3序列基因重排组合(V/J分型)-3D展示图(为测序样本代表图)

2.3 pSS患者和健康对照者CDR3序列长度比较

既往研究认为，CDR3序列长度可以影响CDR3的三维构象，进而影响其抗原结合的特异性。本研究测序发现pSS患者CDR3序列平均长度为(53.03±1.68)bp，显著低于HC组(55.47±1.52)bp(P<0.001)(图2)。

图2 pSS患者和健康对照者CDR3序列长度

2.4 pSS患者和健康对照者CDR3多样性比较

pSS患者D50指数显著低于健康对照者[(0.217±0.014)vs.(0.229±0.020)，P=0.04]，表明pSS患者组CDR3克隆多样性较健康对照组明显下降，某些B细胞存在特异性克隆扩增可能(图3)。

图3 pSS患者和健康对照者的D50指数

2.5 pSS患者和健康对照者V/J基因优势取用

对测序结果进行统计分析，结果显示pSS患者在V功能性家族性基因中，对IGHV1、IGHV4、IGHV5、IGHV6的取用率显著高于健康对照者(P均<0.05)，对IGHV3的取用率显著低于健康对照者(P<0.001)(表1)。

表1 pSS患者和健康对照者V区基因优势取用情况分析

pSS患者在J功能性家族性基因中，对IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3的取用率显著高于健康对照者(P均<0.05)(表2)。

表2 pSS患者和健康对照者J区基因优势取用情况分析

2.6 共享克隆分析

在BCR CDR3受体库基础上筛选出普遍存在于抗SSB抗体阳性pSS患者外周血B细胞BCR H链的优势取用CDR3序列，进一步与健康对照组比较，发现3种与疾病特征性相关的共享克隆型，在pSS患者中存在显著富集现象：包括CARAGMDVW、CARGRYYYYGMDVW、CAKDNKPLNYDILTGQMN-YGMDVW。

3 讨论

pSS患者B细胞高度活化，自身反应性B细胞增加，产生多种自身抗体。自身抗原被B细胞的BCR识别，在共刺激分子及细胞因子的协同作用下发生活化，引发自身免疫反应[13]。BCR经历基因重排、Ig类别转换、体细胞高频突变等过程形成巨大的受体库。高通量测序具有高效、准确、灵敏度高等特点，使建立庞大的BCR库成为可能[14]。BCR免疫组库测序技术已经逐步应用于疫苗研发、肿瘤细胞微小残留病检测、移植后检测以及自身免疫性疾病、移植后疗效监测等[15-16]。

本研究对pSS患者BCR的H链CDR3区进行测序评估，并与健康对照者进行对比分析，评估其多样性特点、CDR3区基因/氨基酸组成特征、各功能基因亚家族偏向取用，以了解其BCR扩增程度和功能状态。通过分析发现CDR3长度及反映BCR多样性的D50指数在pSS患者中显著降低。本研究采用D50指数作为多样性的评价指标。D50是一个描述淋巴细胞抗原受体多样性的概念，其将免疫组库测序结果进行分类整理，按表达量最高到表达量最低排列，然后从高到低地相加，加到50%读段(reads)的时候观察一共包括多少个不同的CDR3序列，即细胞克隆数，克隆数占总数的百分比就是D50指数。健康人因为免疫组库多样性好，免疫细胞总数的50%由许多不同的细胞组成，D50相对较高；免疫细胞存在大量克隆扩增的患者，少数几种大量克隆扩增的细胞可能就占据了免疫细胞的50%，D50值相对较低。提示pSS患者的B细胞存在某些特异性克隆扩增，这与其他自身免疫性疾病免疫组库多样性减低的特点相一致[17]。尽管高通量测序发现的克隆性增生的B细胞未必一定是pSS发生过程中的自身反应性B细胞，但pSS患者整个BCR-CDR3库多样性显著减少，可以初步反映疾病状态下B细胞状态。此外，编码BCR序列的某些特征可能反映克隆具有自身反应性。编码Ig H链V4-34基因(IGHV4-34)主要针对自身抗原表位的反应，并接受严格调控，以防自身免疫反应的发生[18]。Pugh-Bernard等[19]发现初始IGHV4-34阳性细胞在健康人群随着B细胞的发育在生发中心即被清除，避免发育为分泌自身抗体的浆细胞，而在SLE患者中这一免疫耐受过程被打破。Doorenspleet等[18]研究发现在早期RA患者滑液中B细胞IGHV4-34取用率显著增加。本研究通过比较也发现pSS患者IGHV4的取用率显著高于健康人群，IGHV4-34的取用情况值得进一步分析。本研究还发现pSS患者在IGHV区和IGHJ区均存在明显的取用偏向性，这种非随机取用可能参与了自身抗原的识别[20]。CDR3序列长度(氨基酸数目增加)，提示主要与核抗原反应有关，也许可能与自身反应性有关[21]。本研究分析发现抗SSB抗体阳性的患者有3种共享克隆型存在显著富集现象，CDR3序列的高频广泛共用，提示pSS特异性抗原的存在。既往研究表明SSA和SSB抗原均存在不同的优势表位抗原[22-23]。除pSS外，一些结缔组织病(如系统性红斑狼疮)也可以出现抗SSA抗体和抗SSB抗体，后续如果继续扩大样本量对BCR测序结果进行验证，也许可以找到针对pSS患者更具特异性的自身抗原及特异性封闭位点。

与T细胞受体库相比，BCR受体库数据量更大，分析更具复杂性，许多分析方法在不断定义和完善之中[24-25]。本研究利用BCR CDR3受体库较好地展示了pSS患者外周血B细胞在特定的时间空间中BCR CDR3特点，虽然pSS患者临床表现异质性较强，但这些患者B细胞特点较为一致，因此关于其BCR CDR3的分析呈现出许多共性的特征，值得进一步研究，以期能够找到潜在的自身抗原及潜在的治疗靶点，亦或可以通过监测发现特异性突变位点阻止pSS向淋巴瘤进展。