苗青，王燕，任亦欣，关辉，李珍，刘永革，许巍，向莉

支气管哮喘(哮喘)发病本质是气道慢性炎症性疾病，慢性气道炎症的反复持续可进一步造成以平滑肌层增厚、气道管腔狭窄为特征的气道重塑病理改变的发生[1]。大量临床研究证据表明：以气道平滑肌层肥厚为特征的气道重塑，是造成支气管哮喘患儿肺功能进行性减低和气道高反应性持续的病理学基础[2-3]。研究表明在哮喘病理生理过程中，气道平滑肌细胞的表型转换(phenotype switch)是引起气道重塑的重要机制，即气道平滑肌细胞由生理状态的收缩型(contractile phenotype)向合成型(synthetic phenotype)转换，造成细胞收缩功能下降或丧失，导致细胞过度增殖、形态肥大[4-5]。信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription-3, STAT3)属于STAT家族成员之一，被激活后的磷酸化STAT3分子(p-STAT3)可快速移位入核，与靶基因调控区DNA结合启动下游靶基因表达。已证实多种细胞周期反应蛋白均为STAT3信号通路作用底物，因此STAT3信号活性与细胞增生及分化有关[6-7]。国内已有学者报道气道上皮STAT3信号通路的异常活跃与小鼠气道重塑过程相关[8]，但是其在气道平滑肌细胞表型转换过程中的具体作用机制尚不明确。基于此，本研究采用腹腔注射AG490给药方式阻断小鼠STAT3信号通路，AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈脂类衍生物，可特异性阻断JAK2/STAT信号活化及转导[9]，旨在观察特异性拮抗STAT3信号通路在抑制慢性哮喘气道重塑过程中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

STAT3信号通路小分子抑制剂AG490购自美国Calbiochem公司；羊抗鼠STAT3单克隆抗体(sc-8019)、羊抗鼠p-STAT3(结合位点Tyr-705)单克隆抗体(se-8059)、羊抗鼠骨桥蛋白(osteopontin, OPN)单克隆抗体、羊抗鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin, α-SMA)均购自美国Santa Cruz 生物技术有限公司。羊抗鼠平滑肌22α(Smooth muscle 22 alpha, SM22α)单克隆抗体购买自美国Cell Signaling Technology(CST)公司。SDS-PAGE电泳设备及转膜仪、光学显微镜、压缩雾化吸入器、酶标仪等购自上海生工公司。RT-PCR、cDNA试剂盒购自大连宝生物工程有限公司)；卵清蛋白(OVA)、氢氧化铝Al(OH)3购自美国Sigma公司。蛋白浓度测定使用BCA试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验动物与分组

SPF级8周龄BalB/C小鼠30只，体质量(18±2.0)g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。按随机数字表法随机分为3组：正常对照组、哮喘组和AG490干预组，每组10只小鼠。哮喘组小鼠模型制备方法：第1天和第7天腹腔(intraperitoneal/ip)注射致敏液(内含OVA 0.1 mg和氢氧化铝10 mg)0.2 mL，1次/d，共2次。于第14天起经气管(intratracheal/it)滴入激发液(20 μg OVA)0.1 mL，每周5次，连续3周。正常对照组：致敏和激发均以PBS盐水替代。AG490干预组：AG490按0.4 mg/(kg·d)每周腹腔注射1次，共4周，AG490每5 mg用二甲基亚砜(DMSO)、配成质量浓度为0.5 g/L的溶液，OVA激发方法同哮喘组。

1.3 小鼠肺组织切片染色及气道病理组织学观察

切取右肺肺门组织，4%多聚甲醛固定48 h后，常规脱水、透明及浸蜡包埋，制备厚度为5 μm的石蜡切片。切片经常规脱蜡后进行H&E和PAS染色，分别观察肺组织炎性细胞浸润和气道上皮损伤情况。其中上皮细胞层增加的厚度也代表上皮细胞向黏液分泌表型转化的程度，而其可以用杯状细胞面积与基底膜周长(area/pbm)比值表示。

1.4 免疫荧光检测

石蜡标本经脱蜡、水化后，用二抗相同宿主的血清(0.3 mol/mL甘氨酸+1% BSA+3%山羊血清)封闭30 min。加入稀释的一抗(anti-α-SMA)，4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，每次10 min。次日，加入1∶1 000稀释过的偶联荧光二抗。室温下，暗盒中避光孵育1 h。PBS 洗5次，每次10 min。Gold Antifade Reagent with DAPI 封片过夜。借助于共聚焦激光共聚焦扫描、摄像并分析。采用ImageJ图像分析软件定量分析肺组织相关重塑指标，气道平滑肌的厚度以抗α-SMA阳染的平滑肌层平均厚度表示，每个支气管测量10个位置，每个切片至少测量10个支气管。

1.5 小鼠气道原代平滑肌细胞分离及表型标志物蛋白水平检测

取实验小鼠经100% CO2吸入法处死。无菌条件下剪开颈部，从环状软骨下2个气管环取出气管，放入加有100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素双抗的含钙HBSS中漂洗。纵向剪开气管体视显微镜下去除气管周围结缔组织和气管内、外膜。按照文献[10]报道的“胶原酶消化法”分离小鼠原代气道平滑肌细胞，取第4～7代的传代细胞用于后续实验。将PMSF与裂解液按照1∶100混合，每0.1克肺组织加入500 μL变性裂解液中，4 ℃，12 000 rpm/min离心10 min，蛋白浓度测定使用BCA试剂盒，并将各组蛋白总量调整为30 μg/μL。配制SDS PAGE胶，每个泳道加入等量蛋白进行电泳分离，湿法转膜至PVDF膜，使用5%脱脂牛奶封闭30 min后加入抗OPN、α-SMA、SM22α的单克隆抗体4 ℃过夜孵育。次日常温下洗膜3次，加入二抗后孵育2 h。HRP-兔抗羊IgG室温孵育2 h洗涤后于暗室中用ECL发光试剂显影，检测目标蛋白。扫描胶片后用ImageJ软件计算各蛋白条带的灰度值，以相应目的条带与GAPDH的比值做统计分析。每组实验独立重复3次。

1.6 小鼠气道高反应检测

各组小鼠末次激发完成后，使用AniRes 2005 动物肺功能仪检测各组小鼠的气道反应性，具体操作流程如下：腹腔注射麻醉，后将小鼠仰卧位固定于操作台上，眼科剪剪开颈部皮肤，充分解剖暴露气管及颈外静脉；在环状软骨处剪开一向心V型切口，沿该切口缓慢插入气管套管于气管内，手术线固定气管套管。气管插管完毕后，经颈外静脉进行穿刺，细线固定针柄，静脉穿刺针尾部连接三通管，封闭仪器的体积描计箱。气道反应的激发步骤：通过与颈外静脉穿刺针相通的三通管快速注入相应浓度(0、10、20、40、80 μg/kg)的乙酰甲胆碱(Mch)溶液激发气道反应。不同浓度的Mch激发应间隔3 min，并用PBS 冲洗三通管。同时记录不同浓度乙酰甲胆碱激发后小鼠肺阻力变化的最高值代表气道反应性变化。

1.7 统计学分析

以SPSS19.0软件进行统计分析，正态分布计量资料以(均数±标准差)表示，非正态分布的计量资料用中位数(范围)表示。多组间样本均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AG490干预对哮喘模型小鼠行为症状影响

各组小鼠在OVA致敏过程中行为基本无明显异常，而哮喘组小鼠在雾化激发过程以及雾化结束一段时间内，有抓脸抓鼻等瘙痒症状，同时表现有频繁点头等烦躁不安行为，且激发阶段开始后哮喘组小鼠进食进水量均有所减少，哮喘模型建立成功。正常对照组未见上述行为症状，进食未见明显减少。与哮喘组小鼠比较，AG490干预组小鼠亦存在抓脸抓鼻瘙痒症状，及频繁点头等烦躁不安行为，但是频率和程度都较轻，表明采用AG490干预STAT3信号通路可缓解哮喘小鼠经OVA激发期间出现的异常行为症状。

2.2 AG490干预STAT3信号对慢性哮喘小鼠气道结构改变的影响

HE染色行肺组织形态学观察可见经OVA致敏激发后哮喘组小鼠明显气道结构病理改变，包括支气管壁及血管周围有大量炎症细胞浸润、杯状细胞增生、气管管腔狭窄等病理组织改变特征(图1)。经AG490干预后，小鼠肺组织中STAT3蛋白活化水平(p-STAT3/STAT3比值)得到显著抑制[AG490干预组(0.46±0.22)vs.哮喘组(1.13±0.48)，P=0.121；AG490干预组(0.46±0.22)vs.正常对照组(1.55±0.37)，P=0.023](图2)。AG490干预组小鼠气道上皮下α-SMA阳性面积显著低于哮喘组[AG490干预组(1.56±0.24)vs.哮喘组(3.89±0.81)，P=0.011]及正常对照组[AG490干预组(1.56±0.24)vs.正常对照组(1.10±0.32)，P=0.012](图3)。未观察到AG490组小鼠上皮杯状细胞增生与哮喘组相比存在显著差异[AG490干预组(6.77±2.24)vs.哮喘组(7.49±1.89)，P=0.341](图4)。

图4 PAS染色观察气道上皮杯状细胞化生情况

图3 免疫荧光检测拮抗STAT3信号通路对气道平滑肌肥大的影响及量化分析

图2 Western blot检测各组小鼠肺组织中STAT3/p-STAT3蛋白表达水平

图1 H&E染色观察气道壁增厚以及支气管壁周围炎症细胞浸润情况(×400)

2.3 AG490干预STAT3信号对模型小鼠气道高反应的影响

对各组小鼠进行乙酰甲胆碱诱导气道反应性检测结果显示，与正常对照组小鼠相比，以浓度递升的乙酰甲胆碱浓度激发时，哮喘组小鼠的肺阻力呈现增高的趋势，且随乙酰甲胆碱激发浓度不断增高，OVA哮喘组小鼠气道阻力呈现剂量依赖性增高趋势(图5)。提取80 μg/kg 乙酰甲胆碱激发时各组实验小鼠肺阻力变化进行统计学分析，结果显示与哮喘组相比，提前给予AG490干预可以显著降低小鼠气道反应性的发生[AG490干预组(10.90±1.52)cm H2O·s/mLvs.哮喘组(13.99±2.52)cm H2O·s/mL，P=0.015]，差异有统计学意义(表1)。

表1 不同浓度乙酰甲胆碱刺激下各组小鼠气道高反应性变化(cm H2O·s/mL)

图5 各组小鼠气道高反应性测定

2.4 AG490干预对气道平滑肌表型标志物蛋白表达的影响

用“胶原酶消化法”分离培养小鼠原代气道平滑肌细胞，原代培养24 h后可见细胞贴壁伸展，培养2～3 d可见少量细胞贴壁伸展，15 d左右可进行传代。倒置显微镜下观察传代后细胞形态呈典型“峰谷”状排列生长，免疫荧光鉴定细胞表型，经DAPI核染之后确定细胞纯度在99%以上。采用免疫印迹方法检测各组小鼠原代气道平滑肌细胞收缩表型相关蛋白(α-SMA，SM22α)及合成表型相关蛋白(OPN)水平，结果显示：与哮喘组相比，AG490干预组小鼠气道平滑肌细胞收缩表型蛋白α-SMA[AG490干预组(1.09±0.32)vs.哮喘组(0.39±0.12)，P=0.002]和SM22α[AG490干预组(1.39±0.45)vs.哮喘组(2.59±0.34)，P=0.014]表达均显著降低，差异具有统计学意义。虽然观察到AG490干预组小鼠OPN水平虽略有降低，但是与哮喘组相比，组间差异无统计学意义[AG490干预组(0.45±0.21)vs.哮喘组(0.67±0.32)，P=0.232](图6)。

图6 Western blot方法检测各组小鼠肺组织收缩表型和合成表型蛋白标志物表达水平

3 讨论

支气管哮喘病理本质是由多种细胞共同参与的慢性气道性炎症，主要以可逆性气流受限和反复发作为特点，若治疗不积极及时，可持续进展出现气道不可逆性的狭窄及气道重塑等病理结构性改变。

气道重塑病理变化多样，可表现为气道上皮下纤维化，基底膜增厚，肌成纤维细胞及成纤维细胞的聚集，炎症细胞浸润，平滑肌细胞增生肥厚，杯状细胞增生等[11]。目前临床一线激素抗炎治疗对纠正气道重塑的治疗效果尚不理想，其根本原因在于现有对气道重塑的发生机制理解尚不清楚。

STAT3属于STATs家族的一员，介导细胞因子的胞内信号传导通路，经细胞因子激活后的STAT3形成多聚体，然后入核结合调控细胞周期的基因启动子。已证实多种细胞周期蛋白是STAT3的直接作用底物，病理条件下STAT3信号通路的异常，是导致细胞过度增殖活化重要机制之一[12]。不仅如此，研究表明在哮喘气道炎症中STAT3蛋白可通过调控T细胞分化方向，从而发挥其炎症调节的作用。STAT3可通过介导IL-6免疫反应，从而促进更多Th17细胞的分化成熟，在哮喘动物实验中发现与正常对照组相比，哮喘组小鼠肺组织中STAT3与p-STAT3蛋白表达均显著上调，并且跟BALF中IL-6水平呈现正相关[13]。分离哮喘患者的支气管黏膜组织检测到其中p-STAT3蛋白水平显著上升，进一步分离支气管上皮细胞经尘螨变应原(Derp1)刺激可显著上调支气管上皮细胞中p-STAT3的蛋白水平。反之，采用shRNA技术沉默胞内STAT3信号可显著抑制支气管上皮细胞分泌炎症细胞因子及细胞内氧化应激反应，减少过敏原暴露诱发的细胞凋亡现象[14]。上述研究结果提示STAT3信号通路在哮喘气道炎症中发挥重要调控作用，国际上已有应用STAT3小分子抑制剂治疗哮喘的研究报道发表[15]。但是，对于STAT3蛋白在哮喘气道重塑中是否同样具有重要作用尚不可知。气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)是气道中数目最多和体积最大的细胞，其经典作用是动态调节气道内腔口径和壁面硬度变化。最新的研究结果证实终末分化成熟的ASMCs亦具有较大的表型可塑性，异常表型转换过程的发生可能是导致哮喘气道重塑发生的重要机制之一[16-17]。通常状态下ASMCs为收缩表型(contractile phenotype)，收缩反应性强，胞内主要表达平滑肌γ蛋白、平滑肌肌球蛋白重链以及钙调蛋白等表型标志物；但是在外界某种刺激条件下，ASMCs可向合成表型(synthesis phenotype)转化，表现为具有较强增殖能力和分裂能力，而收缩能力明显降低，其主要标记物包括骨架蛋白、非平滑肌肌浆球蛋白重链、波形蛋白等[18]。因此，异常ASMCs表型转换过程的发生，一方面通过促进炎症介质释放和基质蛋白在基底膜沉积，加剧了气道炎症的发生；另一方面又作为哮喘慢性持续化的组织改变基础，加剧了气道重塑过程的出现及恶化，ASMCs的表型转换已成为未来气道重塑研究的新热点。基于此，本研究利用JAK2/STAT信号转导的选择性抑制剂AG490干预小鼠体内STAT3信号活化后经OVA致敏激发，结果显示拮抗STAT3活化后不仅可有效抑制小鼠气道平滑肌层增厚，与此同时还可以有效抑制小鼠气道高反应性的发生。国外学者Gavino等[19]也曾进行过相似报道，采用小分子C188-9拮抗小鼠STAT3信号通路可以改善尘螨变应原激发的哮喘小鼠炎症反应，包括抑制BALF中T相关细胞因子水平(IL-4、IL-5、IL-13、IL-17)以及肺组织中Th2/Th17细胞比例水平。此外，本研究体外分离小鼠原代气道平滑肌细胞，采用免疫印迹方法检测表型相关蛋白表达水平，结果显示与OVA哮喘组相比，AG490干预组小鼠气道平滑肌细胞收缩表型蛋白水平(α-SMA, SM22α)均显著降低，但是未观察到合成表型相关蛋白OPN蛋白水平变化。本课题组研究结果提示：采用AG490拮抗小鼠STAT3信号通路活化可减轻OVA激发所致的气道重塑及气道高反应性的发生，这可能与有效抑制气道平滑肌细胞表型转换的发生有关。