曹逸涵，孙晓川，陈志磊，张硕，赵丽伶，孙金磊，邵体红，董振华，陈华，邓垂文，常晓燕，李永哲，杨云娇，费允云，王立，张奉春

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis, PBC)，旧称原发性胆汁性肝硬化，是一种以肝内小胆管炎症、慢性胆汁淤积及肝纤维化为特征的自身免疫性疾病[1]。研究表明趋化因子CX3CL1及其受体CX3CR1可能在PBC胆管损伤机制中起重要作用。PBC受损胆管微环境内的辅助性T细胞1(helper T cell 1, Th1)型细胞因子和脂多糖，可诱导胆管上皮细胞CX3CL1表达上调，继而使表达CX3CR1的单个核细胞趋化[2]；后者通过产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等细胞因子，加重胆管炎症损伤[3]。

近年研究发现，趋化因子CCL26同样是CX3CR1的功能性配体，可由CX3CR1介导促进CD8+T细胞、自然杀伤(natural killer, NK)细胞和单核细胞的趋化[4]。有研究显示，PBC患者血清CCL26水平显著升高[5]，提示其可能参与PBC发病机制。本研究通过对外周血、肝脏组织病理和体外细胞功能的研究，探究CX3CL1/CCL26-CX3CR1通路在PBC免疫机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 对象

PBC患者来源于2018年1月至5月就诊于北京协和医院风湿免疫科门诊的病例，符合美国肝脏病学会2009年修订的PBC分类标准。同期招募与PBC患者组性别和年龄匹配的健康志愿者。PBC肝脏活检标本来自北京协和医院行肝脏穿刺活检并确诊为PBC的患者，健康对照肝脏标本来源于中国医学科学院北京协和医学院人体组织器官资源库。所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血浆CX3CL1和CCL26浓度测定

收集PBC患者和健康对照者外周血标本，分离血浆。使用酶联免疫吸附检测试剂盒测定血浆中CX3CL1和CCL26浓度。

1.2.2 外周血单个核细胞各亚群中CX3CR1表达水平测定

使用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，采用流式细胞术检测其中CD4+T细胞和CD8+T细胞及其功能亚群(CD28+)，以及NK细胞(CD16+CD56+)和自然杀伤样T(natural killer T-like, NKT-like)细胞(CD3+CD56+)中CX3CR1表达水平。

1.2.3 肝脏组织中CX3CL1和CCL26表达情况检测

采用石蜡切片免疫组织化学染色，使用兔抗人CX3CL1抗体和山羊抗人CCL26抗体，检测PBC患者及健康对照者肝脏病理标本中CX3CL1和CCL26表达情况。

1.2.4 不同刺激下人肝内胆管上皮细胞中CX3CL1/CCL26-CX3CR3通路表达水平变化

将人肝内胆管上皮细胞(human intrahepatic biliary epithelial cell, HIBEC)接种于48孔板，每孔加入500 μL含刺激剂的完全培养基[γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)1 000 U/mL、TNF-α 1 000 U/mL、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)1 000 U/mL、白介素-4(interleukin-4, IL-4)1 000 U/mL、白介素-13(interleukin-13, IL-13)100 ng/mL及脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)1 μg/mL]，同时设置不含刺激剂的对照孔。37 ℃、5% CO2培养72 h。使用1.2.1中的方法检测上清CX3CL1和CCL26浓度，使用流式细胞术检测HIBEC表面CX3CL1和CX3CR1表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23和GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。计量资料使用Shapiro-Wilk法检验正态性，符合正态分布的资料使用独立样本t检验，非正态分布计量资料使用Mann-WhitneyU检验。所有统计结果均采取双侧检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

研究共纳入PBC患者40例，其中女性35例，男性5例，平均年龄(51.4±13.0)岁。入组患者平均血清碱性磷酸酶(ALP)(171.1±113.5)U/L，谷氨酰转肽酶(γ-GT)(152.0±164.4)U/L，丙氨酸氨基转移酶(ALT)(69.9±106.7)U/L，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)(62.8±73.1)U/L，总胆红素(15.05±7.57)μmol/L，抗核抗体阳性85.7%(30/35)，抗线粒体抗体阳性77.1%(27/35)，抗线粒体抗体M2亚型阳性82.9%(29/35)，抗GP210抗体阳性35.7%(10/28)，抗SP100抗体阳性10.7%(3/28)。研究共纳入健康对照者18例，平均年龄(46.4±7.3)岁，全部为女性。

2.2 血浆CX3CL1和CCL26水平

PBC组血浆CX3CL1浓度为(0.690±0.271)ng/mL，显著高于健康对照组(0.540±0.101)ng/mL，差异有统计学意义(P=0.044)。PBC患者血浆CCL26浓度为(8.94±4.09)pg/mL，较健康对照者(6.75±1.86)pg/mL有升高趋势，但没有达到统计学显著性(P=0.104)。

2.3 PBMC各亚群CX3CR1表达水平

与健康对照者比较，PBC患者CD4+T细胞中CX3CR1+细胞比例显著增多[(5.5±5.4)%vs.(13.7±9.0)%，P=0.003]，且这一差异在其CD28+功能亚群[(2.3±1.4)%vs.(4.4±2.5)%，P=0.013]和CD28-非功能亚群[(62.3±25.5)%vs.(82.8±19.3)%，P=0.009]中均显著。CD8+T细胞及其亚群CD8+CD28+、CD8+CD28-T细胞中CX3CR1+细胞比例在PBC患者和健康对照者间无显著差异(图1)。

图1 PBC患者与健康对照者PBMC中CD4+和CD8+亚群CX3CR1表达水平

CX3CR1在NK细胞中有极高水平表达，PBC患者与健康对照者比较差异无统计学意义[(93.9±12.6)%vs.(97.5±1.8)%，P=0.173]。CX3CR1在NKT-like细胞中有较高水平表达，PBC患者CX3CR1+细胞比例显著高于健康对照者[(78.6±18.0)%vs.(63.5±25.4)%，P=0.026](图2)。

图2 PBC患者与健康对照者PBMC中NK和NKT-like细胞CX3CR1表达水平

2.4 肝脏组织CX3CL1和CCL26表达情况

PBC患者胆管上皮细胞同时高表达CX3CL1和CCL26，CX3CL1在胆管上皮的表达更为显著；健康对照者胆者管上皮细胞管腔面细胞膜弱表达CX3CL1，未见CCL26表达(图3)。

图3 PBC患者和健康对照者胆管上皮细胞CX3CL1和CCL26表达情况

2.5 不同细胞因子及LPS刺激下HIBEC CX3CL1/CCL26-CX3CR1通路表达水平变化

与培养基血清体系相比，HIBEC在无刺激条件下有低水平的CX3CL1分泌[(0.095±0.009)ng/mLvs.(0.581±0.054)ng/mL，P<0.001]。在IFN-γ刺激下，培养液上清中CX3CL1浓度升高最为显著[(3.897±0.205)ng/mL，P<0.001]；TNF-α刺激下升高幅度次之[(1.062±0.169)ng/mL，P=0.009]；IL-1β、IL-4、IL-13及LPS刺激下亦有较小幅度升高。在IFN-γ刺激下，HIBCE表面CX3CL1表达水平显著升高(P=0.041)，而TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-13及LPS刺激下则无显著变化(图4)。

图4 不同刺激下HIBEC培养液上清及细胞表面CX3CL1表达水平变化

以培养基血清体系为对照[(12.13±0.61)pg/mL]，在无刺激下HIBEC培养液上清中可检测到低水平的CCL26表达[14.50±0.98)pg/mL，P=0.024]。CCL26主要在IL-4[(26.37±0.24)pg/mL，P<0.001]和IL-13[(24.10±3.26)pg/mL，P=0.008]等辅助性T细胞2(helper T cell 2, Th2)型细胞因子刺激下表达增加，在IFN-γ刺激下亦有小幅升高[(17.20±1.34)pg/mL，P=0.048]，而在TNF-α、IL-1β及LPS刺激下无显著变化(图5)。

图5 不同刺激下HIBEC培养液上清中CCL26水平变化

较无刺激状态，HIBEC表面CX3CR1表达水平在IFN-γ刺激下显著升高(P=0.020)，而在TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-13及LPS刺激下无显著变化(图6)。

图6 不同刺激下HIBEC细胞表面CX3CR1表达水平变化

3 讨论

趋化因子及其受体在PBC胆管炎症的诱发及维持中起重要作用，其与细胞因子和炎症介质等相互作用，共同促进多种免疫细胞的趋化和激活，最终导致肝内胆管进行性破坏及纤维化。趋化因子CX3CL1及其受体CX3CR1被认为是介导PBC胆管炎症的标志性分子，CX3CL1也成为近年PBC研究重点关注的潜在治疗位点[6]。2010年，CCL26被发现同样是CX3CR1的功能性配体[4]，为这一领域的研究带来了新的方向。

本研究发现PBC患者血浆CX3CL1水平显著升高，CCL26水平有升高趋势，但没有达到统计学显著性。Landi等[5]报道，PBC患者血清CCL26水平显著高于健康对照者及慢性丙型病毒性肝炎患者。Lin等[7]亦发现类似现象，且发现血清CCL26水平与PBC组织学分期呈负相关，提示CCL26可能主要在病程早期发挥作用。本研究受样本限制未能对此展开研究，未来可扩大样本量并按病程分层进一步分析。

在受体层面，本研究发现PBC患者外周血NKT-like细胞、CD4+T细胞中CX3CR1+细胞比例显著升高。Fallon等[8]曾报道，在慢性胆总管结扎所制造的胆汁淤积动物模型中，血管内单核细胞CX3CR1表达升高。Liaskou等[9]则报道，原发性硬化性胆管炎患者肝脏中增多的CD4+CD28-T细胞表达CX3CR1。值得注意的是，研究未发现PBC患者CD8+T细胞CX3CR1表达水平显著升高，这与Shimoda等[10]的发现相符合，其报道PBC患者肝脏中自身反应性CD4+T细胞比例是外周血的100倍，而自身反应性CD8+T细胞是外周血的10倍，可能与CD4+T细胞CX3CR1表达水平较CD8+T细胞升高更显著有关。近年来，越来越多的研究表明NK、NKT细胞等固有免疫相关细胞在PBC发病机制中可能起重要作用[11]。本研究发现PBC患者NKT-like细胞CX3CR1表达水平显著升高，而NK细胞CX3CR1在PBC患者和健康人中均存在极高表达，亦支持这一观点。

组织病理方面，本研究发现PBC患者受累汇管区胆管上皮细胞高表达CCL26。Guo等[12]早先报道，CCL26在肝脏和心脏中高表达。Chiu等[13]则报道，CCL26在肝细胞肝癌坏死周围区域呈现梯度表达。本研究显示，CCL26与CX3CL1可同时表达于PBC患者胆管上皮细胞，提示两者可能在PBC中协同介导相关免疫细胞的趋化和胆管损伤。

本研究证实，体外培养的人肝内胆管上皮细胞在IL-4和IL-13等Th2型细胞因子刺激下高表达CCL26。先前研究报道，IL-4刺激下的血管内皮细胞可表达CCL26[14]；体外培养的肝细胞肝癌细胞系CCL26表达水平上调[15]。Park等[16]则研究发现，胆酸可抑制IL-13刺激下食管鳞状上皮细胞CCL26的表达。考虑到熊去氧胆酸是PBC治疗的一线药物，胆酸能否抑制肝内胆管上皮细胞CCL26的表达值得探究。此外，本研究发现HIBEC中CX3CL1表达水平在Th1型细胞因子IFN-γ刺激下显著升高，在Th2型细胞因子IL-4和IL-13刺激下有较小幅度的升高，提示CX3CL1和CCL26可能在不同免疫状态下协同介导PBC胆管的损伤。

研究亦发现，在IFN-γ刺激下人肝内胆管上皮细胞CX3CR1表达显著上调。Kumiko等[2]报道，胆管上皮同时存在CX3CL1和CX3CR1 mRNA和蛋白质表达，并均在PBC损伤胆管中表达上调。Brand等[17]则发现，小肠上皮细胞中CX3CL1可以经CX3CR1介导通过自分泌的形式促进自身表达。胆管上皮细胞中CX3CL1和CCL26的表达是否存在上述自分泌或旁分泌机制，值得进一步研究。

本研究存在若干局限。首先，研究的样本量较少，且初治患者较少，多数患者病情稳定，可能难以反映疾病活动期情况。其次，研究未能收集到足够的随访数据，而对各项指标随治疗的变化及与治疗反应的相关性展开探讨。此外，研究未能充分揭示CX3CL1/CCL26-CX3CR1通路上下游信号分子的变化及具体分子机制，有待未来进一步研究。

综上，笔者提出假说：在遗传和环境因素的共同作用下，肝内小胆管炎症异常激活，在局部以IFN-γ为主的细胞因子刺激下，胆管上皮细胞CX3CL1和CX3CR1表达升高，CX3CL1可能通过自分泌途径进一步促进其自身的表达；同时，在局部IL-4和IL-13的刺激下，胆管上皮细胞CCL26表达升高。CX3CL1和CCL26可能协同诱导CX3CR1表达增高的NKT-like细胞趋化，并促进NK细胞、T细胞的趋化，进而加重胆管上皮损伤。