陈怡河南师范大学

高通量测序技术及其发展

陈怡
河南师范大学

摘要：高通量测序技术是DNA测序的革命性技术创新，具有同时对几十万到几百万条DNA分子进行测序和一般的读长较短的功能。速度快、准确率高、成本低，实现了对物种基因组或转录组的深入研究。该文详细介绍了高通量测序技术的种类和测序原理，以及各种测序平台的发展进程和优缺点。

关键词：高通量测序技术；454焦磷酸测序；Solexa测序；SOL⁃ID测序；第三代测序技术

自1975年Frederick Sanger和Walter Gilbert创建DNA测序技术以来，DNA测序飞跃发展，成为分子生物学及临床医学等领域的重要研究技术。Sanger测序法在测序量和微量化等方面具有一定的局限性。高通量测序与单分子测序技术相继涌现，为大规模测序提供了技术支持。

1　高通量测序技术

高通量测序技术运行数据量大，可以同时对数百万个DNA分子实施序列检测。高通量测序平台主要包括Roche公司/454焦磷酸测序、Illumina公司/Solexa聚合酶合成测序及ABI公司/SOLID连接酶测序。

以Roche/454焦磷酸测序为例，该技术的检测原理为，第一步把DNA单链运用PCR进行扩增与引物杂交，杂交后产物与ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、荧光素酶及5’磷酸硫腺苷一起反应孵育。此过程中dNTP会依次加入到引物上。加入的dNTP若与模板配对便释放相同数量的焦磷酸基团。ATP硫酸化酶催化焦磷酸基团生成ATP，ATP驱动荧光素酶催化荧光素向氧化荧光素转化并发出与ATP含量成线性关系的可见光信号。之后ATP与未反应的dNTP及时被降解。再生的反应体系进入到下一种dNTP循环，根据所得信号峰值图可获得DNA序列信号。此技术读取长度最长，但通量最低。当测序遇到多聚核苷酸时（如AAAAAA）时，碱基个数与荧光信号强度不再成线性关系，所以在检测具有重复序列的DNA片段时具有困难。454焦磷酸测序法常用的平台为GS FLX Titanium sequencing Kit XL+。

Solexa聚合酶合成测序技术读取的片段多，测序通量高，高度自动化，适合大量小片段DNA的测序。但可逆反应时随反应次数的增加效率降低、信号减弱，且读长短，从头测序具有困难。该技术广泛应用的测序平台为MiSeq。

SOLiD连接酶测序每个碱基读取两次，准确性较高，特别是针对SNP的检测，适合检测参考基因序列。在三种测序技术中，该技术测序读长为50bp最短，读取长度受反应次数限制。ABI 3730 XL等测序平台被广泛应用。

2　第三代代测序技术

第三代测序技术指Pacific Bioscience公司的单分子实时测序技术（SMRT），Helico BioScience公司单分子测序技术（TIRM），以及Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子测序技术。新一代测序技术达到长读取长度、高通量、低成本的目的。不同于第二代测序，第三代分子测序不需进行PCR扩增，DNA模板与固体表面结合后边合成边测序。

2.1Pacific Bioscience SMRT技术

Pacific Bioscience公司的SMRT技术基于边合成边测序的原理，采用Zero-ModeWaveguide（ZMW零级波导）。测序过程为：被荧光标记的核苷酸与模板链结合在聚合酶活性位点上（每种脱氧核苷酸由不同颜色染料标记），激发出不同荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割释放，聚合酶转移到下一个位点，下一个脱氧核苷酸连接到位点上进行荧光脉冲，进入下一测序过程。

2.2Helico BioScience TIRM技术

Helico BioScience公司的基于全内反射显微镜的测序技术——单分子测序技术（TIRM）同样利用边合成边测序的原理，随机打断待测序列成小分子片段，用末端转移酶在小片段的3’末端添加poly(A)，在poly(A)末端实施阻断及荧光标记，将小片段与带有poly(T)的平板杂交，加入聚合酶和被荧光标记的脱氧核苷酸进行DNA合成，每循环一次加入一种dNTP，之后洗脱去除未合成的DNA聚合酶和dNTP，对Cy3成像，检测模板位点上的荧光信号，对核苷酸上的染料裂解释放，加入下一种dNTP和聚合酶，进行下一轮循环。

2.3Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术

纳米孔测序技术的原理不同与前两种技术，DNA分子或其碱基从孔洞经过时会影响固有光信号和电流。OxfordNanopore纳米孔单分子测序技术采用α—溶血素构建孔洞，核酸外切酶黏附在孔洞外表面，传感器（环糊精）结合到孔洞的内表面。之后脂双分子层包裹纳米孔。脂双分子层两侧为不同盐浓度，并提供合适的物理条件。在合适电压下，核酸外切酶催化断裂DNA单链，碱基进入纳米孔中，与孔内的环糊精反应，影响流过纳米孔的固有电流，每个碱基都能产生特定电流，运用该方法可将不同碱基区分开来。

3　高通量测序技术的展望

近年间，高通量测序被广泛应用到各领域，新一代测序技术也取得突飞猛进的进展，但后续的海量测序数据分析，以及如何以生物知识去解释和应用都存在问题。但总体上，新一代测序技术的费用已大大降低，具有精确度高、速度快、敏感性强等显著特点。随着高通量测序技术的飞跃发展，相信在不久的将来，测序技术会在生物、医学等领域发挥更加重要的作用。

参考文献：

[1]岳桂东,高强,罗海龙,等.高通量测序技术在动植物研究领域中的应用[J].中国科学,2012,42(2):107-124.

[2]王兴春,杨致荣,王敏,等.高通量测序技术及其应用[J].中国生物工程,2012,32(1):109-114.

[3]刘莉扬,张学工.高通量测序技术在临床医学中的应用进展[J].医学综述,2013,19(16):2971-2973.

作者简介：陈怡（1995-），女，汉，本科，河南省永城人，河南师范大学生命科学学院。