王雪刚 张新枝 杨澍 甘苏琴 刘诗 郝坤艳 周彬 于乐成

近年来，随着乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)抗病毒药物，主要是核苷(酸)类似物(Nucleoside/nucleotide Analogues, NAs)的广泛使用，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的病毒复制及肝脏炎症均得到了很好的控制[1-2]。在丙氨酸氨基转移酶(ALT)等肝生化指标持续正常、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)下降不明显、HBV DNA和HBeAg检测不出的情况下，如何更精准地监测患者病毒复制情况和选择合理的停药时机，是目前临床实践中常见的问题[3]。随着这些新问题的提出，HBV RNA作为新的可能反映肝细胞内HBV cccDNA水平的血清学指标，近年来迅速成为临床和相关基础研究人员关注的一个热点。

HBV是一种DNA病毒，近年来一直以血清HBV DNA水平作为反映患者病毒复制水平的指标。血清HBV RNA的检测早在1994年就有文献报道，研究者利用PCR和RT-PCR可以同时从HBV相关肝癌和CHB患者血清检测到HBV DNA和HBV RNA[4-5]。由于当时对HBV RNA临床意义的认知不如HBV DNA和HBsAg明确，所以在相当长的时间里未得到临床医生和科研工作者应有的重视。2015年以来，研究者们发现在HBV DNA获得持续抑制的患者中，仍然能检测到血清HBV RNA，其存在的意义和价值立即引起了临床医生和研究者的极大兴趣[6-8]。

随着对血清HBV RNA临床应用的关注，许多检测HBV RNA的方法和试剂盒也应运而生。我们对比了文献报道中常用的“互补DNA末端快速扩增法”(rapid amplication of complimentary DNA-ends，RACE)和一种Sansure国产试剂盒检测CHB患者血清HBV RNA的效能，采样两种方法对治疗和未治疗患者血清中的HBV RNA水平检测值进行了评价，以期探讨不同检测方法在临床应用中的一致性和可替代性。

资料与方法

一、研究对象

收集2018年6—9月在南方医科大学南方医院肝病门诊就诊的CHB患者，排除接受干扰素、合并丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒等其他病毒感染的患者。共纳入101例，其中未接受NAs治疗患者39例，曾经或正在接受NAs治疗者62例，均为参加常规随访的患者。所有患者均已签署知情同意书，项目经南方医科大学南方医院伦理委员会批准。

二、HBV DNA及HBsAg等血清学指标的检测

三、血清HBV RNA检测

第二种方法采用圣湘公司HBV RNA定量试剂盒(科研用HBV RNA PCR-荧光探针法定量检测试剂盒，Sansure法试剂盒)，在公司技术人员指导下，完全按照试剂盒说明的步骤操作。通过逆转录 HBV 核酸中的 pgRNA(经 DNA 酶消化)，利用针对 HBV pgRNA 序列设计的一组特异性引物与荧光探针，配以 PCR 反应液，应用一步法逆转录实时荧光定量 PCR 检测技术，通过荧光信号的变化实现 HBV pgRNA 的定量检测。PCR 检测体系含有阳性内对照(内标)和四个定量参考品，通过检测内标基因来监测提取核酸中是否具有 PCR 抑制物，评价核酸提取的质量，避免 PCR 假阴性。PCR 检测体系含有内参比荧光 ROX，用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值。

四、统计学处理

采用Graphpad 8.0软件进行统计分析及统计绘图，组间均值比较采用t检验；HBV DNA与HBV RNA及两种HBV RNA检测结果的相关性采用R值进行计算；两种方法检测的HBV RNA 在未治疗和治疗患者中的一致性用Bland-Altman图表示；两种HBV RNA之间的关系采用线性回归方程表示。

结 果

一、患者一般情况

101例患者的性别、年龄分布、HBeAg阳性的人数，以及ALT、HBsAg、HBV DNA水平的中位数和范围见表1。

表1 治疗组和未治疗组患者的一般情况

二、治疗组和未治疗组的HBsAg水平和HBV DNA水平

两组患者的HBsAg水平差异有统计学意义(P=0.0023)，未治疗组的HBsAg平均值明显高于治疗组(3.382与2.691 lg U/L)。HBV DNA水平在两组间差异有统计学意义(P<0.001)，未治疗组的HBV DNA平均值明显高于治疗组(5.842对1.656 lg IU/mL)。见图1。

图1 治疗组和未治疗组患者HBsAg和HBV DNA水平比较

三、两种HBV RNA检测方法的检测效能

按照Sansure法的试剂说明，其线性范围为 3×102～1.00×109拷贝/mL，检测下限(Low level of detection, LOD)为100拷贝/mL. 本实验室按照文献建立的RACE法的线性范围为4×103～4×1010拷贝/mL，LOD为3 890 拷贝/mL。虽然数值显示RACE法比Sansure法的LOD更高，但是在本研究中检测相同的临床样本，RACE法比Sansure法的检测值平均高出0.68 lg 拷贝/mL。

四、治疗组和未治疗组的HBV RNA水平

两组患者的血清HBV RNA水平在治疗组和未治疗组间差异有统计学意义，但差异不如HBV DNA水平的组间差异显著(P=0.0134)。两种方法相比，RACE法比Sansure法检测到的阳性患者更多，分别在101例患者中检测出60和56例。RACE法比Sansure法的检出平均检值更高，分别为3.16 lg 拷贝/mL和2.53 lg 拷贝/mL。治疗组中RACE和Sansure的HBV RNA平均值分别为2.259 lg 拷贝/mL和1.650 lg 拷贝/mL(P=0.153 2)；未治疗组中RACE和Sansure的HBV RNA平均值分别为4.583 lg 拷贝/mL和3.878 lg 拷贝/mL(P=0.308 6)。两种方法检测值的差异无统计学意义(图2)。

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图2 治疗组和未治疗组患者HBV RNA水平比较

五、治疗组和未治疗组患者HBV DNA与HBV RNA水平的相关性

在治疗组中血清HBV DNA水平与HBV RNA水平没有相关性，RACE法R2= 0.440 6，Sansure法R2= 0.508 1(图3A)。

在未治疗组中，两种方法均显示血清HBV DNA水平与HBV RNA水平显著相关，RACE法R2=0.844 8，Sansure法R2= 0.866 7(图3B)。

将治疗组和未治疗组混合分析，相关性不佳，RACE法R2= 0.610 0，Sansure法R2= 0.653 0(图3C)。

RACE法和Sansure法的HBV RNA检测值具有显著的相关性。总体上两种方法检测值经相关性检验为R2=0.8740，具有显著相关性(图3D)。

两种方法在治疗和未治疗患者中的一致性采用Bland-Altman图表示(图4)。以两种测量结果的差值为纵轴，以测量结果的均数为横轴，绘制散点图，用虚线标注出95%一致性界限(95% limits of agreement, 95% LoA)。95% LoA的范围较窄(两个目标之间的差值在治疗组为-1.789到0.22 lg 拷贝/mL，未治疗组为-2.25到0.53 lg 拷贝/mL)。以RACE法为基准，Sansure法的偏差在治疗组为-0.78 lg 拷贝/mL，在未治疗组为-0.86 lg 拷贝/mL。偏差值均小于2，两种检测值的一致性好(图4)。经deming线性回归分析，以Race法结果作为X，以Sansure法结果作为Y，两者的回归方程为Y=0.9189X-0.3754。

图3 HBV DNA水平与HBV RNA水平的相关性及两种HBV RNA检测值的相关性

图4 两种检测方法HBV RNA水平在治疗和未治疗患者中的Bland-Altman一致性分析

讨 论

HBV在复制过程中会产生5种HBV mRNA，在早期的研究中，研究者们虽然利用RT-PCR检测到血清中存在HBV RNA，但未进一步探索其具体组成。近年报道血清HBV RNA有3.5 kb pgRNA、截断的RNA、剪切的RNA等多种存在形式[10-12]。2016年Wang 等利用HBV 特异性引物分别扩增并定量检测血清总HBV RNA(包括上述5种mRNA)和HBV 3.5 kb mRNA，发现总HBV RNA的量与3.5 kb mRNA的量无明显差异，因此推断血清中HBV RNA主要为3.5 kb mRNA，而3.5 kb mRNA包括两种mRNA，即pre-C mRNA和pgRNA。Wang等进一步设计HBV特异性引物分别扩增pre-C mRNA与pgRNA的总和，结果未检测到pre-C mRNA扩增产物，因此证实血清HBV RNA主要是3.5 kb pgRNA[7]。2018年，Bai等报道血清中HBV RNA主要是pgRNA或3’端已被降解的pgRNA，长度从3.5 kb到几百bp之间呈现出异质性，这些RNA主要存在于核心颗粒中，大多数以抗原抗体复合物的形式存在于血清中，少数也存在于完整的病毒颗粒中[13]。

本文应用的RACE法即是只能检测带A尾的HBV RNA，由于其第一步逆转录时的引物只能靶向A尾，因此只有带A尾的RNA能被检测出来。而本文应用的Sansure法则是需要DNA酶消化的一步法RT-qPCR法，该方法的好处是可以同时检测带A尾和不带A尾的RNA；缺点是应用DNA酶消化后，一方面需要质控HBV DNA是否已经被完全消化干净(试剂盒设计了相关质控对照)，另一方面需考虑DNA酶对HBV RNA也有消耗作用(Sansure试剂盒无相关质控对照)，这会导致HBV RNA的水平被低估。从理论上讲，Sansure法能检测的RNA种类更多，其水平应该更高。但是本研究结果显示RACE法在未治疗和治疗患者中的检测值均高于Sansure法。除了考虑到不同方法的敏感性不同，还需考虑DNA酶对HBV RNA的消耗作用可能影响了Sansure法的检测水平。

另外，我们也注意到，治疗组和未治疗组的HBV DNA水平具有显著差异，而HBV RNA的水平差异没有HBV DNA显著，在治疗组患者中这种趋势更加明显。这种情况的出现主要是由于在接受治疗的患者中大多数HBV DNA已经转阴，但是部分患者HBV RNA仍然是阳性。在62例治疗组患者中，HBV DNA阳性患者为21例，Sansure法检测的阳性患者为26例，RACE法检测的阳性患者为31例。这使得各组的平均值也有所不同，提示Sansure法的敏感性仍有改进和提升空间。

两种检测方法在治疗组患者中均比HBV DNA能检测到更多阳性患者，这主要是由于NAs治疗阻断了HBV RNA的逆转录过程，而对从cccDNA到HBV RNA的转录过程并没有影响。由于HBV RNA是cccDNA的直接下游产物，患者从HBV DNA转阴到HBV RNA转阴还需要cccDNA的耗竭作为中间过程，我们最近的一项研究阐明了这中间的时间差[15]。在血清HBV DNA与HBV RNA水平的相关性分析中，只在未治疗组患者中观察到了两者的显著相关性，而在治疗组患者中未观察到相关性。这也与上述NAs治疗阻断HBV RNA逆转录的机制有关。这部分结果也与雅培公司的报道一致[16]。虽然实验效能评价中LOD数值Sansure法比RACE法更低，但是相同样本用两个方法同时检测的检测值则是RACE法更高，这主要是由于两个方法使用的标准品不一致：RACE法采用本实验室自己合成的标准品，Sansure法采用相应试剂盒提供的标准品，其线性范围和LOD值并不具有可比性。如果HBV RNA检测能像HBV DNA的检测系统一样，有世界卫生组织(World health organization, WHO)提供的统一的以IU为单位的标准品进行标定，则不同平台的结果，其线性范围和LOD之间才具有可比性[17]。

虽然从原理上来说，本研究的两种方法检测的是不同种类的HBV RNA，即Sansure法可同时检测带A尾和不带A尾的RNA，而RACE法只能检测到带A尾的RNA。但是我们的结果显示，总体上Sansure法和RACE法的相关性和一致性较好，并可通过线性回归公式由一个检测值推算出另一个检测值。雅培公司建立了一种自动化的、同时靶向X区和C区的HBV RNA检测方法，其结果用HBV DNA的标准品作为参比时，在治疗的患者中HBV RNA的水平比HBV DNA平均高(2.45 ± 1.13)lg[16]。但在我们的结果中，治疗组患者中除了HBV DNA阴性的样本外，Sansure法和RACE法的平均检测值均低于HBV DNA的检测值。说明这两种检测方法的效能仍需进一步提高。

在未接受NAs治疗的患者中，血清HBV DNA水平与HBV RNA水平具有很好的相关性，因此用HBV DNA水平来检测HBV的复制水平是很可靠的办法。但是在接受NAs治疗的很多患者血清HBV DNA已经低于LOD，这时候血清HBV RNA即成为更有效、更可靠的监测病毒复制和预测临床疗效的标志物。我们已经发现RACE法在较多的研究报道中被应用于预测NAs和干扰素治疗应答或者病程进展，具有较好的预测效能。目前尚未见Sansure法应用于临床的报道。另外，两种方法均未见应用于NAs停药复发的预测[6, 8, 18-19]。鉴于目前尚无HBV RNA的标准检测方法，没有统一标准品，也没有批准用于临床检测的商业试剂盒，不同方法的临床应用场景还需进一步探索。因此，较合理的做法是我们在应用HBV RNA水平作为标志物用于病情监测和预测应答之前，首先需要对不同的方法学进行比较和评估，然后再挑选出合适的方法应用于临床相关研究。