黄元兰，李 丹，仲人前

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一类好发于中年女性的器官特异性自身免疫性疾病，以胆管内进行性非化脓性炎症为病理学特征，以抗线粒体抗体(AMA)阳性为血清学特征[1]。持续的炎症反应损伤了胆管上皮细胞，导致胆道闭塞和胆汁淤积。长期的胆汁淤积又加重了胆管内的炎症反应，由此形成的“恶性循环”，最终会引起肝脏的纤维化和肝功能衰竭[2]。

干扰素共分为3种类型，分别为I型、II型和III型。其中，I型干扰素主要包括干扰素-α(IFN-α)和IFN-β，二者主要通过内分泌或旁分泌的方式发挥作用[2]。当I型干扰素与其受体结合后，可以启动多个基因的表达。这些基因通常被称为干扰素诱导基因(ISG)。从I型干扰素与其受体结合到ISG表达的信号通路被称为I型干扰素信号通路。以往的研究表明，I型干扰素信号通路亢进是多种自身免疫性疾病的共同特征[3-4]。但是PBC患者I型干扰素信号通路是否亢进仍不明确。

在本研究中，笔者分析了PBC患者外周血I型干扰素浓度以及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)内多个ISG的表达，以分析I型干扰素信号通路是否亢进及是否参与了PBC的发病机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2012年5-12月于海军军医大学附属长征医院和长海医院确诊的38例PBC患者为研究对象(PBC组)。其中：男9例，女29例，平均年龄为51岁。PBC的诊断标准为美国肝病学会2000年推荐的PBC诊断指南[5]。所有的PBC患者均未合并其他自身免疫性疾病、恶性肿瘤和终末期肾病，在血液标本采集前的1个月内也无明显的感染性疾病病史。对照组为同期来该院体检的患者中选择了30例健康人群作为对照组。PBC组和对照组的临床特征见表1。统计分析结果表明PBC患者的肝酶、胆红素等指标均较健康个体增高，2组患者在年龄和性别构成比上的差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究得到了该校伦理委员会的批准，所有研究对象均签署了知情同意书。

表1 对照组和PBC组患者的临床特征

1.2 ELISA检测 于患者接受治疗前，抽取患者静脉血5 ml，以EDTA-K2抗凝。以3 000 r/min(离心半径r=20 cm)的速度离心10 min分离血浆。将血浆分装至EP管中，置于-80 ℃保存待测。待所有血清收集完成后，室温下复融，采用ELISA法检测血浆IFN-α和IFN-β水平，ELISA试剂盒购自美国R&D公司，实验操作过程均按照实际说明书进行。

1.3 PCR扩增 采用密度梯度离心法分离受试对象PBMC，之后采用Trizol法提取总RNA，随后进行逆转录和聚合酶链式反应(PCR)扩增，检测3个ISG(IFIT3、MX1和OAS1)的表达，所用内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。IFIT3的正向引物序列为AACTACGCCTGGGTCTACTATCACTT，反向引物序列为GCCCTTTCATTTCTTCCACAC；MX1的正向引物序列为GGGTAGCCACTGGACTGA；反向引物序列为 AGGTGGAGCGATTCTGAG；OAS1的正向引物序列为GAAGGCAGCTCACGAAAC，反向引物序列为 TTCTTAAAGCATGGGTAATTC；GAPDH的正向引物序列为CCATCAATGACCCCTTCATTG，反向引物序列为CATGGGTGGAATCATATTGGAAC。每个样本做3个复孔，Ct值为3复孔的均值。根据公式ΔCt=[Ct(目的基因)]-[Ct(内参基因)]和ΔΔCt=[ΔCt(疾病组)]-[ΔCt(对照组)]，计算2-ΔΔCt，即为疾病组各基因表达量相对于正常组的倍数[6]。

1.4 统计学处理 以独立样本t检验或者Mann-Whitney U检验比较2组数据之间的差异是否具有统计学意义。所有统计学处理过程均在SPSS 17.0 for Windows或GraphPad Prism 6.0中进行。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PBC患者外周血IFN-α和IFN-β水平分析 如图1所示，与对照组相比，PBC患者外周血IFN-α和IFN-β水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：与对照组比较aP<0.01。PBC为原发性胆汁性肝硬化，IFN为干扰素图1 PBC组和对照组血清I型干扰素水平比较

2.2 PBC患者PBMC中干扰素刺激基因(IFIT3、MX1和OAS1)的表达分析 如图2所示，PBC患者PBMC中的干扰素刺激基因(IFIT3、MX1和OAS1)较健康个体明显增高(均P<0.01)。

注：与对照组比较a，P<0.01。PBC为原发性胆汁性肝硬化图2 PBC组和对照组外周血单个核细胞中干扰素刺激基因的表达

3 讨论

I型干扰素主要包括IFN-α和IFN-β，其免疫学功能主要是直接抑制病毒的复制，此外还具有重要的免疫调理作用，可以通过调节免疫细胞的方式间接发挥抗病原体效应[7-8]。I型干扰素生物学效应的发挥主要是通过干扰素刺激基因来实现的，当I型干扰素与其受体IFNAR结合后，胞内的STAT1和STAT2形成二聚体，并进一步与IRF9组装，形成了干扰素刺激基因因子3(ISGF3)。ISGF3进入细胞核之后，可以启动多个基因的表达，这些基因就是干扰素刺激基因。干扰素刺激基因的生物学功能十分广泛，包括正向或负向调节细胞的凋亡、调节免疫应答的强度等。I型干扰素反应就是指I型干扰素诱导干扰素刺激基因表达的过程。

I型干扰素反应是把双刃剑，虽然适当的I型干扰素反应有助于免疫系统清除病原体，但是I型干扰素反应亢进则会引发自身免疫性疾病。在本研究中，笔者首先采用ELISA法检测了PBC患者外周血的I型干扰素(IFN-α/β)水平，发现PBC患者外周血I型干扰素水平较健康个体明显增高。同时，笔者还采用了PCR法检测了PBC患者PBMC中的3个干扰素刺激基因的表达情况，且表达明显增高，这提示I型干扰素反应亢进是PBC的重要特征。

以往的研究表明，PBC的发病机制与感染有关[9]，而感染本身又会活化I型干扰素信号通路。笔者推测，在PBC发病过程中可能存在如下过程，病原体感染首先导致个体外周血I型干扰素增加，进而活化了I型干扰素反应。I型干扰素反应亢进后导致了肝脏的自身免疫反应，肝脏胆管上皮细胞被免疫系统杀伤后，释放了较多的自身抗原。这些自身抗原可以进一步导致又进一步促进了免疫反应，导致I型干扰素反应的持续活化，形成了恶性循环。

总之，本研究发现PBC患者外周血I型干扰素信号通路过度活化，结合以往关于I型干扰素信号通路参与自身免疫性疾病发病机理的研究证据，提示I型干扰素信号通路是PBC潜在的治疗靶点。