雷彩红 张毅

肝纤维化是肝硬化早期病变状态。有研究发现，肝星状细胞在肝纤维化进程中起到重要作用，被激活的肝星状细胞在肝损伤部位激活、增殖并大量分泌I型胶原和III型胶原，从而加快了肝硬化进程[1]。普萘洛尔可用于治疗肝硬化静脉曲张破裂出血，有研究指出其在肝硬化治疗中具有潜在应用价值[2]。本研究通过体外实验发现，普萘洛尔具有抑制肝星状细胞增殖、促进其凋亡的功效，同时还能够降低肝星状细胞I型及III型胶原的分泌，对延缓肝硬化进程具有重要意义，现详述如下。

资料与方法

一、实验材料

(一)主要仪器设备 thermo371型细胞培养箱(美国热电公司) ； Ts2 NIKON相差显微镜(日本尼康有限公司)；TG16G台式高速离心机 (江苏亿能有限公司)；赛多利斯 Practum124-1CN电子天平(德国赛多利斯公司)；Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher有限公司)；ChemiScope Touch化学发光成像仪(中国勤翔有限公司)。

(二)主要试剂 胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM(美国Gibco公司)；盐酸普萘洛尔片(中国药品生物制品检定所)；人I型胶原ELISA试剂盒(德国默沙克生物有限公司)；人III型胶原ELISA试剂盒(德国默沙克生物有限公司)

(三)研究对象 实验选用肝星状细胞购自空军军医大学细胞库。

二、试验方法

(一)细胞复苏及传代培养 将冻存管取出后置入37℃的温水中，不断摇动直至冻存液融化，吸出冻存液并放入5 mL培养液，离心机离心5 min，弃去上清液后，于离心管中再加入5 mL培养液，吹打为细胞悬液转移至培养瓶中，37℃、5%二氧化碳条件下实施细胞培养，注意每日更换培养液；

观察细胞铺满瓶底后，加入胰酶后使用显微镜进行细胞消化情况观察，待细胞质回缩、细胞间隔增大后倒掉消化液，再加入5 mL血清细胞培养液，吹打瓶壁上的细胞至其成为单细胞悬液，离心7 min，再次加入培养液吹打为新的单细胞悬液，并分装入不同的培养瓶中继续培养，实施传代培养。

(二)细胞分组及干预 将肝星状细胞分为5组，分别为对照组、生理盐水组、A组、B组、C组，其中对照组加入细胞和培养液，生理盐水组加入细胞、培养液和生理盐水，A组加入细胞、培养液、10 μmol/L的盐酸普萘洛尔，B组加入细胞、培养液、50 μmol/L的盐酸普萘洛尔，C组加入细胞、培养液、100 μmol/L的盐酸普萘洛尔，干预时间均为24 h，培养环境均为37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件。

三、观察指标及评测标准

(一)细胞形态变化 使用显微镜对5组细胞干预前后形态进行观察，并进行前后及组间的对比；

(二)细胞增殖及凋亡情况 待细胞干预24 h后，加入10 μL的水溶性四唑盐-1溶液再培养2 h，而后使用M2酶标仪在450 nm波长处测定吸光度，以此推断细胞增殖程度，其原理为水溶性四唑盐-1溶液可以被线粒体内的脱氢酶还原为橙黄色，因而细胞增殖越快，则颜色越深，细胞增殖越慢，则颜色越浅；

细胞凋亡情况的测算选择FACS法，待细胞培养24 h后，弃去细胞上层清液，使用无菌PBS冲洗两遍后收集细胞沉淀，并使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

(三)细胞I型胶原及III型胶原浓度测定 采用ELISA法分别使用I型胶原及III型胶原试剂盒检测5组细胞I型胶原及III型胶原浓度，每个指标检测3次，取平均值待用。

(四)MMP-2及TNF-α水平测定 MMP-2及TNF-α水平的检测也采用ELISA法实施，待5组细胞干预24 h结束后使用试剂盒分别测定其浓度，每个值检测3次，并取平均值待用。

(五)VEGF及PDGF水平检测 VEGF及PDGF水平的检测同样采用ELISA法实施，待5组细胞干预24 h结束后使用试剂盒分别测定其浓度，每个值检测3次，并取平均值待用。

四、统计学方法

结 果

一、细胞形态变化

经观察发现，处理后对照组及生理盐水组肝星状细胞细胞形态与干预前对比变化不大，细胞生长状态良好，贴壁良好，细胞间隙较小，较为紧密，细胞呈纺锤形或不规则形，大小均匀，胞浆丰富；而A、B、C三组细胞均出现明显的细胞密度降低，贴壁不牢固，细胞间连接疏松，胞体变细长，且随着普萘洛尔浓度的增加，细胞死亡现象愈加明显。

二、细胞增殖及凋亡情况

经检测发现，生理盐水组与对照组相比增殖及凋亡无明显变化(P>0.05)，A、B、C三组细胞均出现增殖降低，凋亡增加现象，与对照组相比差异明显(P<0.05)，同时随着普萘洛尔浓度的提升细胞增殖抑制及凋亡现象愈加明显(P<0.05)，具体数据如表1所示。

表1 5组细胞增殖与凋亡情况对比

三、不同组别细胞I型胶原及III型胶原浓度对比

经检测发现，生理盐水组与对照组相比Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原浓度差异不大(P>0.05)，而A、B、C三组Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原浓度明显比对照组降低(P<0.05)，同时随着普萘洛尔浓度的提升Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原浓度下降更为明显(P<0.05)，具体数据如表2所示。

表2 不同组别细胞I型胶原及III型胶原浓度对比

四、不同组别细胞MMP-2及TNF-α水平对比

经检测对比发现，生理盐水组与对照组相比MMP-2及TNF-α水平差异不大(P>0.05)，A、B、C三组MMP-2及TNF-α水平明显降低(P<0.05)，且随着普萘洛尔浓度的提升下降幅度越大(P<0.05)，具体数据如表3所示。

表3 不同组别细胞MMP-2及TNF-α水平对比

五、不同组别细胞VEGF及PDGF水平对比

经检测对比发现，生理盐水组与对照组相比VEGF及PDGF水平差异不大(P>0.05)，A、B、C三组VEGF及PDGF水平明显降低(P<0.05)，且随着普萘洛尔浓度的提升下降幅度越大(P<0.05)，具体数据如表4所示。

表4 不同组别细胞VEGF及PDGF水平对比

讨 论

有研究结果指出，可以通过对肝星状细胞病变进程的监测来推测肝纤维化进程[3-5]。本研究就普萘洛尔通过PDGFR/Akt途径抑制肝星状细胞活化进而预防肝硬化的效果进行了探究，结果显示，相比于未实施干预的对照组细胞及使用生理盐水干预的生理盐水组细胞，加用普萘洛尔干预的A、B、C三组肝星状细胞其形态发生了明显的变化，细胞密度下降、细胞间连接变疏松，同时A、B、C三组细胞的增殖程度均下降、凋亡率上升，I型及III型胶原浓度下降，MMP-2、TNF-α、VEGF及PDGF水平下降，相比于对照组及生理盐水组差异明显。通过分组干预可以发现，普萘洛尔能够起到一定的抑制肝星状细胞增殖、加快其凋亡、缓解炎性状态的作用。本研究分析可通过以下途径来对肝星状细胞实施干预：(1)抑制肝星状细胞增殖；(2)加速肝星状细胞凋亡；(3)逆转肝星状细胞的活化，使其再次进入静止状态；结果显示，普萘洛尔的加入抑制了肝星状细胞的活化，加速了其凋亡进程，同时进一步组间对比结果显示，随着普萘洛尔剂量的增加，肝星状细胞增殖程度下降，凋亡率升高，这说明普萘洛尔确实具有潜在的抑制肝纤维化作用。本研究结果还提示普萘洛尔对I型胶原、III型胶原、MMP-2、TNF-α的分泌具有抑制作用，这与上文中炎性状态会加快肝纤维化进程相呼应。而对VEGF及PDGF水平的影响则解释了普萘洛尔能够抑制肝星状细胞增殖的机制，其原因为普萘洛尔能够通过PDGFR/Akt途径来降低VEGF及PDGF水平，抑制新生血管的出现，进而起到缓解肝纤维化进程的作用。

总而言之，普萘洛尔具有抑制肝星状细胞增殖、促进其凋亡的功效，同时还能够降低肝星状细胞Ⅰ型及Ⅲ型胶原的分泌，对延缓肝硬化进程具有重要意义。