曹国龙 刘光源 刘小坡 冯云波 刘家寅 田发明

1.唐山市工人医院骨外科，河北 唐山 063000 2.石家庄市第三医院骨外科，河北 石家庄 050000 3.唐山市第二医院骨外科，河北 唐山 063000 4.华北理工大学医学实验研究中心，河北 唐山 063210

大约40%的女性一生中会经历一次脆性骨折[1]。而在骨折患者中，又会有10%～15%的比率出现骨折愈合延迟[2]，其中老年人会占很大比例。发生骨折的老年女性患者，常同时患有2型糖尿病和骨质疏松症。它们不仅使骨折发生率明显升高[3]，还不同程度地影响着骨折的愈合[4-6]。

胰岛素是治疗2型糖尿病的常用药物之一，它对骨折愈合的影响值得研究。而双膦酸盐类药物广泛应用于骨质疏松患者的治疗，它主要是对破骨细胞功能有明显的抑制作用[7]。而唑来膦酸作为新一代双膦酸盐类药物，每年只需静脉输入一次(5 mg)既可明显降低骨质疏松性骨折的发生率[8]。并且唑来膦酸较其他抗骨质疏松药物不仅有更好的疗效[9-10]，还有着更好的依从性[11]。但长期应用此类药物可延迟骨痂重建[12]，骨折后如何应用值得深入研究。基于以上原因，本课题参照以往文献[13-14]，通过高脂饲料喂养联合注射低剂量链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病大鼠模型。在此基础上行双侧卵巢切除，建立2型糖尿病并发雌激素缺乏股骨干闭合性骨折动物模型，通过给予胰岛素或联合唑来膦酸治疗，以研究其对于本模型骨折早期愈合的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

2月龄雌性(Sprague-Dawley，SD)大鼠，购于北京维通利华公司，许可证号：SCXK(京)2015-0001，体重(219.64±11.48) g。

1.2 实验分组

32只大鼠随机分为4组(n=8)：对照组(control fracture，CF)、2型糖尿病并发骨质疏松骨折组(T2DM+Osteoporosis+Fracture，DOF)、胰岛素治疗组(T2DM+Osteoporosis+Fracture+Insulin，DOFI)和胰岛素联合唑来膦酸治疗组(T2DM+Osteoporosis+ Fracture +Insulin+Zoledronic acid，DOFIZ)。本实验严格遵守实验动物伦理原则，各项操作均通过伦理委员会批准。实验流程见图1。

图1 实验流程Fig.1 Flow chart of the experimental procedures注：“_”：普通饲料喂养；“...”：高脂饲料喂养；STZ：腹腔注射STZ；OVX：双侧卵巢切除；：建立闭合性股骨干骨折模型；：取材；“Insulin”：胰岛素治疗；“Insulin +Zoledronic acid”：胰岛素联合唑来膦酸治疗。

1.3 实验大鼠饮食

CF组正常大鼠饲料喂养，其余3组高脂饲料喂养(H10141，北京华阜康生物科技股份有限公司)。

1.4 建立2型糖尿病及雌激素缺乏动物模型

三实验组大鼠高脂饲料喂养3周后，以35 mg/kg给予其腹腔注射STZ[14]。一周后测晨起空腹血糖，以大于13.9 mmol/L为标准[15]，未达标者被排除。STZ注射1周后，三实验组大鼠行双侧卵巢切除。

1.5 胰岛素控制血糖

DOFI组和DOFIL组大鼠在STZ注射1周后，给予胰岛素(诺和灵N，Novo Nordisk A/S)皮下注射，剂量为早2～4单位、晚4～6单位[16]。

1.6 建立股骨干闭合性骨折模型

实验第10周建立骨折模型。手术流程：麻醉后术区剃毛、消毒、铺单。于大鼠右膝关节内侧切长约2 cm纵行切口，并屈曲膝关节，向外侧脱位髌骨，于股骨髁间插入制备好的20 G注射器针头[17]，缝合切口。用500 g重物自30 cm高度坠落撞击，致大鼠右侧股骨中段闭合性骨折[18]。

1.7 唑来膦酸给药方法

骨折模型建立后，DOFIL组大鼠即刻以0.1 mg/kg给予唑来膦酸注射液(正大天晴药业集团股份有限公司，规格：100 mL：5 mg)皮下注射[12]。

1.8 采集X线片并分析

骨折后第3周，通过数字放射成像系统(DR 7500)拍摄右侧股骨干全长X线片，对其行骨折愈合评分[19]，并利用Image Pro Plus6.0软件测量X线片中骨痂面积[20]。

1.9 Mirco-CT分析

利用mCT-40系统对骨痂组织扫描。设置检测参数及测量区域：骨折线平面作为基线，向两侧各选择381层的轴位片[21]。分析指标：骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation，Th.Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨体积分数(bone volume/tissue volume，BV/TV)。

1.10番红O-固绿染色及分析

骨组织经脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后行番红O-固绿染色。用光学显微镜(奥林巴斯BX53，日本)采集图像，通过Image Pro Plus6.0软件分别圈选骨痂及其中的骨和软骨组织，计算各组织所占骨痂总面积的比值[22]。

1.11抗酒石酸酸性磷酸酶染色及分析

切片经脱蜡、水合后，依次滴加抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)固定液、孵育液，经Lea苏木素复染、脱水、透明、封片。采集图像后分析TRAP阳性破骨细胞密度[23]。

1.12免疫组织化学染色及分析

切片经脱蜡、水合后，依次滴加胰酶、内源性过氧化物酶阻断剂、一抗：骨钙素(osteocalcin，OCN)抗体(bs-0470R，博奥森生物有限公司)，半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)抗体(ab179517，Abcam Corp.)，4 ℃过夜，滴加二抗(PV6000)，DAB溶液显色，再经复染、返蓝、脱水、透明和封片。采集图像后行免疫组织化学评分(Immunohistochemical score，IHS)[24]。

1.13统计学分析

2 结果

2.1 大鼠基本情况

STZ注射后3只大鼠死亡(DOF组2只，DOFI组1只)，DOFI组和DOFIZ组各有1只大鼠血糖未达标均去除。

2.2 大鼠空腹血糖值

三实验组大鼠在STZ注射后空腹血糖均明显升高。胰岛素治疗后，DOFI组和DOFIL组大鼠空腹血糖均趋于正常。见图2。

图2 4组大鼠血糖变化Fig.2 Blood glucose changes in the four groups

2.3 骨折愈合X线评分及骨痂面积

DOF组和DOFI组骨折愈合X线评分显著低于CF 组(P<0.05)，DOFI组和DOFIZ组显著高于DOF组(P<0.05)，DOFIZ组与CF组、DOFI组间均无显著差异；DOFIZ组骨痂面积显著高于其余3组(P<0.05)，此3组间无显著差异。见图3。

图3 各组大鼠X线表现(A)、骨折愈合X线评分(B)及骨痂面积(C)Fig.3 Representative radiographies (A), radiographic healing score (B), and callus area (C) in rats of each group注：与CF组比较，aP<0.05；与DOF组比较，bP<0.05；与DOFI组比较，cP<0.05。

2.4 Micro-CT分析结果

三实验组TB.N和BV/TV均显著低于CF组(P<0.05)，DOFI组和DOFIZ组显著高于DOF组(P<0.05)，DOFIZ组显著高于DOFI组(P<0.05)；三实验组Tb.Sp显著高于CF组(P<0.05)，DOFIL组显著低于DOF组和DOFI组(P<0.05)，DOF组和DOFI组间无显著差异；4组间Tb.Th均无显著差异。见图4。

图4 各组大鼠骨痂Mirco-CT三维重建图像(A)及各指标分析结果(B～E)Fig.4 Three-dimensional reconstruction images (A) and results of micro-CT analysis of the callus (B-E)注：与CF组比较，aP<0.05；与DOF组比较，bP<0.05；与DOFI组比较，cP<0.05。

2.5 番红O-固绿染色及分析结果

CF组和DOFIZ组骨性骨痂面积比均显著高于DOF组和DOFI组(P<0.05)，DOFI组显著高于DOF组(P<0.05)，CF组和DOFIZ组间无显著差异；4组间软骨性骨痂面积比均无显著差异。见图5。

图5 各组大鼠骨痂番红O-固绿染色(×20)(A)及组织形态学分析结果(B、C)Fig.5 Safranin O-Fast Green staining of the callus (×20, A) and histomorphometric analysis results (B, C)注：与CF组比较，aP<0.05；与DOF组比较，bP<0.05；与DOFI组比较，cP<0.05。

2.6 TRAP染色及TRAP阳性破骨细胞密度

CF组和DOFIZ组TRAP阳性破骨细胞密度均显著低于DOF组和DOFI组(P<0.05)，DOFI组显著低于DOF组(P<0.05)，CF组和DOFIZ组间无显著差异。见图6。

图6 各组大鼠骨痂TRAP染色(×200)(A)及TRAP阳性破骨细胞密度(n/mm2)(B)Fig.6 TRAP staining of the callus (×200, A) and TRAP-positive osteoclasts per callus area (n/mm2, B)注：与CF组比较，aP<0.05；与DOF组比较，bP<0.05；与DOFI组比较，cP<0.05。

2.7 骨痂内OCN和Caspase-3免疫组织化学染色结果及分析

三实验组骨痂内OCN的表达均显著低于CF组(P<0.05)，DOFI组和 DOFIZ组显著高于DOF组(P<0.05)，DOFI组和 DOFIZ组间无显著差异。

DOF组的骨痂内Caspase-3的表达显著高于其余3组(P<0.05)，DOFI组和DOFIZ组显著高于CF组(P<0.05)，DOFI组和 DOFIZ组间无显著差异。见图7。

图7 各组大鼠骨痂内OCN(A)和Caspase-3(B)的免疫组织化学染色(×200)及免疫组织化学评分(C、D)Fig.7 Immunohistochemistry staining (×200, A, B) and immunohistochemical score (HIS, C, D) for OCN and Caspase-3 in the callus注：与CF组比较，aP<0.05；与DOF组比较，bP<0.05；与DOFI组比较，cP<0.05。

3 讨论

本实验在2型糖尿病并发雌激素缺乏骨折动物模型基础上，研究了单独应用胰岛素或联合早期单剂量唑来膦酸对其早期骨折愈合的影响。结果表明，联合用药不仅进一步抑制了骨痂内破骨细胞活性，提高了其骨性骨痂面积比，还明显改善了其骨痂的微结构。

本研究中，实验大鼠并发有影响骨折愈合的两种疾病：2型糖尿病和雌激素缺乏[25-26]，它们之间关系密切并相互影响[27-28]。DOF组不仅骨折愈合X线评分明显低于CF组，而且其Tb.N、Tb.Sp、BV/TV、骨性骨痂面积比以及OCN的表达也明显受损。另外，DOF组破骨细胞密度及Caspase-3的表达均明显高于CF组，这与以往研究结果也相似[29]。DOF组骨痂各项指标受损正是以上两种疾病共同作用的结果。

经胰岛素干预后，DOF组各项受损指标中除了Tb.Sp以外均得到了明显改善，这与以往的研究结果相似。胰岛素不仅能逆转因糖尿病引起的骨痂内软骨细胞凋亡和破骨细胞增加[29]，还能改善其骨痂的骨量及微结构[30]。胰岛素的作用可能是多方面的。首先，它直接扭转了高血糖状态对成骨细胞的抑制作用[27]；另外，它不仅能促进血管内皮生长因子的表达[31]，还能促进OCN的分泌[32]。本实验结果也显示，DOFI组OCN的表达明显增高。尽管胰岛素有诸多有利作用，但一些研究却表明其与骨折风险增加有关[33-34]。而有趣的是，胰岛素应用时间与骨折风险无关[34]，这表明骨折风险的增加可能不是来自于其对骨代谢的直接影响，而可能是由于胰岛素治疗引起的低血糖增加了跌倒事件中骨折的发生[35]。

DOFIZ组按0.1 mg/kg给予大鼠唑来膦酸皮下注射，这相当于人类每年接受一次的5 mg的药物剂量[12]。骨质疏松症患者常是在骨折发生后才被确诊，此时能否立即行唑来膦酸治疗值得深入研究。大鼠骨折愈合的组织学表现会比人类早1～2周，其骨折后3周相当于人类的第4～5周，是骨性骨痂形成和骨痂重塑相交的重要阶段[36]，故本实验选此时为研究靶点。破骨细胞在此时骨吸收和重建中起着重要作用[10]，而唑来膦酸的主要作用机制就是抑制其功能。本研究表明，DOFIZ组破骨细胞密度显著低于DOFI组，而它们OCN的表达并无显著差异，这与以往的研究结果一致[37]。另外，Caspase-3在DOFIZ组也没有得到明显改善。以上结果表明，早期应用唑来膦酸主要抑制了骨痂内破骨细胞功能，而对于成骨活性和软骨性骨痂的矿化并无明显影响。正是因为破骨细胞功能受损，使得DOFIZ组在骨折后第3周保留了更多骨性骨痂，使其骨性骨痂面积比显著高于DOFI组，并且其骨折愈合X线评分和骨性骨痂面积比与CF组相当，甚至其骨痂面积明显大于其他3组，Tb.N、Tb.Sp和BV/TV也得到了显著改善，这与以往研究结果相似[12，38-39]。这些研究也表明，虽然双膦酸盐类药物会延迟骨痂重建，但这并不能降低早期骨痂的结构强度，较大的骨痂反而增强了其生物力学性能。骨折端早期稳定性的增加使患者能更早的功能锻炼，这对于控制血糖、预防多种卧床并发症，甚至是骨痂重塑都有重要意义。

有研究还指出，破骨细胞在骨痂早期重建中并不是起骨吸收作用的唯一因素。骨痂早期重建是多种基质金属蛋白酶协同作用的结果[40]。并且唑来膦酸单次给药只与短期内骨痂组织结合[12]，并不影响其后新生的骨组织[39]，虽然这在一定程度上影响了早期骨痂重建，但是对于骨折的最终愈合并无明显影响[38]。另外，唑来膦酸不仅不会增加糖尿病的患病风险[41]，还有利于减轻胰岛素抵抗[42]和糖尿病并发症的治疗[43]。

本实验结果表明，针对患2型糖尿病的绝经后女性骨折患者，在给予胰岛素控制血糖的同时，可考虑早期联合单剂量唑来膦酸治疗，这对于此类患者的治疗有一定的指导意义。