张念军 区作明,3 李雪 陈茹 王昌兵 刘少华 汤琪 杨海韵 邓向亮

1.广州中医药大学，广东 广州 510006 2.广州中医药大学附属佛山中医院骨十科，广东 佛山 528000 3.佛山市高明区中医院骨科，广东 佛山 528500 4.南方医科大学顺德医院中医科，广东 佛山 528300 5.广东药科大学中医学院，广东 广州 510006

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种骨骼系统疾病，临床上以骨量、骨密度损失等为主要特征，多见于中老年人，尤以绝经后女性为甚，成为21世纪的第5大疾病[1]。我国是OP发病的大国，随着我国人口老龄化的进一步加剧，据预测，2020年我国将有近3亿OP患者， 约占世界的50%以上[2]。OP主要分为三大类：原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症和特发性骨质疏松症[1]。其中，原发性骨质疏松症最为常见，又可分为Ⅰ型骨质疏松症即绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)及Ⅱ型骨质疏松症即老年性骨质疏松症；原发性骨质疏松中，PMOP占大多数[3]。女性在绝经后即开始出现骨量丢失的增加，绝经后5～10年是骨丢失的高峰期。佛山市中医院使用骨宝丸治疗骨质疏松症，取得了较好的临床疗效。骨宝丸主要由熟地、仙茅、山萸肉、淫羊藿、淮山药、龟板、当归等药物组成，具有补肝肾、强筋骨、健脾胃、益气血的功效[4]。经临床应用30余年，证实骨宝丸对骨质疏松、骨折愈合迟缓、股骨头无菌性坏死及肝肾亏损诸症，有理想的临床疗效[5-9]。然而目前的研究多以临床疗效评价为主，缺乏相关的药理实验，尤其是作用机制和物质基础尚未清楚。因此，本研究参考文献用维甲酸诱导小鼠以建立骨质疏松模型，考察骨宝丸对小鼠骨质疏松的防治作用，并从骨形成的角度探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物：SPF级健康BALB/c小鼠30只，雌性，体质量 18～22 g，购于广东省医学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(粤)2013-0002，饲养于广州中医药大学SPF级动物实验室。

1.1.2主要药物与试剂：骨宝丸(佛山市中医院院内制剂，粤药制字Z20060052，由熟地、仙茅、山萸肉、淫羊藿、淮山药、龟板、当归等10多种药物组成)；维甲酸，为美伦生物科技有限公司生产；小鼠骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、血清骨钙素(osteocalcin，OC)、血清Ⅰ型原胶原N-端前肽(procollagen type 1 N-peptide，P1NP)ELISA 试剂盒，均为博奥森生物公司生产；小鼠骨特异性碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)ELISA 试剂盒由CUSABIO公司生产。

1.1.3主要仪器： Micro-CT(Aloka Latheta LCT200，Hitachi-Aloka)；电热恒温培养箱(DHP-9272，上海齐欣科学仪器有限公司)；酶标仪(Multiskan FC，Thermo)。

1.2 方法

1.2.1动物分组与造模：小鼠分成 5组，即正常组(Control)、模型组(Model)、骨宝丸高剂量组(GBW-H)、骨宝丸中剂量组(GBW-M)和骨宝丸低剂量组(GBW-L)，每组6只。实验第 1～30 天，除正常组给予RO水之外，其余各组小鼠灌服维甲酸造模，剂量为100 mg/kg，每天一次，连续30 d。

1.2.2动物给药：按人每天服用剂量的10倍剂量作为小鼠给药的中剂量(即3 g/kg)，分别以中剂量组的2倍、1/2倍剂量作为高剂量(6 g/kg)和低剂量(1.5 g/kg)。实验第 1天开始，骨宝丸各剂量组小鼠分别灌胃给予对应剂量的药物溶液，给药体积为 0.2 mL/10 g，每天1 次，连续30 d；正常组和模型组给予等量RO水。

1.2.3观察股骨形态：取小鼠股骨，称取质量，利用电子数显卡尺测量股骨中间段直径和股骨长度；取股骨经10%中性甲醛固定、5%甲酸脱钙，然后按常规方法制备石蜡切片，并进行HE染色，光学显微镜下观察股骨组织形态，并拍照。

1.2.4检测骨密度(bone mineral density，BMD)：利用Micro-CT扫描小鼠股骨，计算BMD(mg/cm3)。

1.2.5ELISA检测：摘眼球取血至干净的EP管，样品在室温静置20 min，然后离心(800 g，20 min)，分离血清后按照ELISA试剂盒的说明检测血清中BMP-2、OC、BALP、P1NP的含量。

1.3 统计学分析

数据以均数±标准差的形式表示，采用 Graphpad 5制作统计图，并利用其自带的统计软件进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠股骨形态的影响

与正常组比较，模型组小鼠的股骨在形态上发生以下变化：肉眼观察表面颜色显枯白色、股骨头变细(图1)，股骨直径和质量均显著减小(P<0.01，图1B、1C)，股骨长度未见显著变化(图1D)；这提示维甲酸造成小鼠股骨形态发生了较显著的改变。与模型组比较，骨宝丸各剂量组小鼠的股骨形态有较大改善，其中肉眼观察骨形态较粗壮，并呈现淡红色(图1 A)；股骨头、骨质量和股骨直径均显著大于模型组(P<0.01或P<0.05，图1B、图1C)。

图1 小鼠股骨形态 A：股骨形态；B：股骨直径(横径)；C：股骨质量；D：股骨长度；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。Fig.1 Morphology of mouse femur. A: morphology of the femur; B: diameter of the femurs (Transverse diameter); C: weight of the femurs; D: length of the femurs; Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01.

图2 骨宝丸对维甲酸诱导的小鼠股骨组织的影响(×100)Fig.2 Effect of GBW on the tissue of femur in retinoic-induced mice (×100)

2.2 对小鼠股骨组织的影响

本研究利用HE染色法观察小鼠股骨组织变化情况，实验结果如图2所示，正常组小鼠的骨髓组织丰富而内含大量的骨髓细胞，而模型组的骨髓组织显著减少；与模型组比较，骨宝丸各剂量组的骨髓组织显著增多。由于正常的骨髓组织内含大量骨髓细胞，其中包括部分红细胞，这使正常的股骨表面隐隐显现淡红色，因此结果也可以部分解释了模型组小鼠的股骨经肉眼观察显枯白色的原因。

2.3 对股骨密度的影响

BMD是骨质量的一个重要标志，反映骨质疏松程度，预测骨折危险性的重要依据。本实验研究结果显示，与正常组比较，模型组的BMD显著降低(P<0.05)；而与模型组比较，骨宝丸各剂量组的BMD有不同程度的升高，其中高、中剂量组与模型组比较差异均具有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 骨宝丸对维甲酸诱导的小鼠股骨BMD的影响(与模型组比较，*P<0.01)Fig.3 Effect of GBW on the BMD of femur in tretinoin-induced mice (Compared with model group, **P<0.01)

2.4 对血清OC和P1NP分泌的影响

血清中OC和P1NP是反映骨形成的标志物，在绝经期骨质疏松妇女中这两个指标都会存在升高的现象，因此成为评价绝经期骨质疏松程度的重要指标。本实验采用ELISA试剂盒检测了小鼠血清中OC和P1NP的分泌水平。结果显示，模型组血清中OC和P1NP水平显著高于正常组(P<0.05)；与模型组相比，骨宝丸各剂量组OC和P1NP水平含量有不同程度降低：其中，骨宝丸各剂量组OC水平呈一定的剂量依赖性降低，且与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01或0.05，图4 A)；同时，骨宝丸中、高剂量组的P1NP水平显著低于模型组(P<0.01或0.05，图4B)。

2.5 对血清BMP-2和BALP分泌的影响

为了进一步探讨骨宝丸防治维甲酸诱导的小鼠骨质疏松形成的机制，本实验采用ELISA试剂盒检测了小鼠血清中BMP-2和骨形成分化标志酶BALP的分泌水平。实验结果如图5所示，模型组小鼠血清中BMP-2和BALP分泌水平均显著低于正常组(**P<0.01)；而骨宝丸各剂量组小鼠血清BMP-2和BALP分泌水平都不同程度地高于模型组的，其中骨宝丸各剂量组小鼠血清BMP-2分泌水平与模型组的比较差异均具有统计学意义(P<0.05或0.01，图5 A)，骨宝丸高、中剂量组小鼠血清BALP分泌水平与模型组的比较差异均具有统计学意义(P<0.05或0.01，图5B)。

图4 骨宝丸对维甲酸诱导的小鼠血清OC(A)和P1NP(B)分泌水平的影响(与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01)Fig.4 Effect of GBW on the secretion of OC (A) and P1NP (B) in the serum of tretinoin-induced mice (Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01)

图5 骨宝丸对维甲酸诱导的小鼠血清BMP-2(A)和BALP(B)分泌水平的影响(与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01)Fig.5 Effect of GBW on the secretion of BMP-2 (A) and BALP (B) in the serum of tretinoin-induced mice (Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01)

3 讨论

本研究考察骨宝丸对维甲酸诱导小鼠制备骨质疏松的影响，并从影响骨形成角度入手探讨其作用机制。实验结果表明骨宝丸对维甲酸诱导小鼠骨质疏松有显著的防治作用，其作用机制可能与促进股骨形成有关。

PMOP在原发性骨质疏松中所占比例较高，因此无论是临床还是实验研究均较多。在动物实验研究中，卵巢切除和维甲酸诱导是制备绝经后骨质疏松模型的常用方法，其中维甲酸诱导具有操作简单、重复性高、动物无死亡等优点，所以本研究参考文献方法采用维甲酸诱导小鼠制备骨质疏松模型[10-11]。实验结果表明，维甲酸诱导的小鼠股骨质量、密度、直径、骨髓组织均显著减少，而且血清中骨代谢标志物OC和P1NP 分泌水平显著升高，而促进骨形成相关蛋白BMP-2和BALP分泌水平显著降低。本研究结果与临床报道的PMOP具有较高的一致性，即PMOP为高转换型的骨质疏松，除了具有骨质疏松的一般特性，还因为骨转换活跃，同时存在亢进的骨吸收与骨形成，临床可见骨代谢标志物OC和P1NP 分泌水平升高[12-13]。

佛山市中医院的院内制剂骨宝丸临床治疗骨质疏松有很好的疗效。本实验结果表明骨宝丸能拮抗维甲酸诱导的小鼠股骨质量、密度、直径、骨髓组织减少，该结果与临床报道的骨宝丸有改善PMOP患者骨密度、减少骨量丢失的功效相吻合[6]，同时与骨宝丸提高卵巢切除诱发骨质疏松大鼠的骨密度的实验报道一致[5]。实验结果提示骨宝丸对维甲酸诱导的小鼠骨质疏松有防治作用。为进一步探讨骨宝丸防治骨质疏松的作用机制，本研究考察了小鼠血清中骨形成相关代谢物OC、P1NP、BMP-2和BALP的分泌水平。结果表明骨宝丸可拮抗维甲酸诱导的骨质疏松小鼠血清中OC和P1NP的分泌。OC和P1NP是敏感性好、特异性高的骨形成标志物，一般反映骨细胞活性及骨功能状态，然而PMOP作为高转换型的骨质疏松，骨形成和骨吸收都较为活跃，临床报道患者血清OC和P1NP会出现升高[12-14]，其中骨形成和骨吸收都会释放OC，这可能是OC在PMOP中升高的主要原因[15]。此外，本研究结果还显示骨宝丸可拮抗维甲酸对小鼠血清BALP和BMP-2的抑制作用。BMP是一类与骨组织生长相关的多功能糖蛋白，BMP-2是其中诱导成骨活性最强的蛋白之一[16]；BALP是由成骨细胞分泌的一种糖蛋白，具有促进骨组织的生成作用，是骨形成的标志物之一[17]； BMP-2 通过促进BALP 分泌，诱导BMSCs 向骨形成分化[18]。通过局部植入BMP-2不但可以促进骨折愈合[19]，还能改善骨质疏松动物的骨质[20]。因此，实验结果还提示骨宝丸防治维甲酸诱导的小鼠骨质疏松可能与促进骨形成有关。

综上所述，骨宝丸可防治维甲酸诱导的小鼠骨质疏松，其作用机制可能与保护BMP-2及其下游调控分子BALP分泌进而促进骨形成有关。