李 丹,谢芝勋,李 孟,罗思思,谢丽基,张民秀,黄娇玲,范 晴,王 盛,谢志勤,邓显文,曾婷婷,张艳芳

(广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西 南宁 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)是正黏病毒科成员。根据其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase, NA)的差异可以将AIV划分为18种不同的HA亚型(H1～H18)和11种不同的NA亚型(N1～N11)[1-3]。另外,依据其对鸡致病性的不同,还可将AIV分为高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)。H9亚型AIV自1966年在美国威斯康星州首次被发现以来,目前已经在全球给家禽养殖业造成了严重的经济损失[4]。1998年在中国广东首次发现了H9N2亚型AIV直接感染人的病例,此后H9N2亚型AIV感染人的病例也不断有报道[5]。H10亚型AIV于1949年在德国鸡体内首次被发现[6]；研究表明H10亚型AIV感染的宿主主要为水鸟和其它陆生禽类[7]。目前感染人的亚型主要是H10N7和H10N8亚型,已经有报道的国家包括澳大利亚、埃及和中国[8]。更为严重的是江西南昌地区已经于2013年12月发现1例H10N8直接感染人的病例[9]。近年来在低致病性禽流感的流行病学的监测中发现H9和H10亚型禽流感病毒混合感染普遍存在[10]；相关研究还表明部分H9N2亚型AIV可以为H5N6、H10N8及H7N9等感染人的亚型禽流感病毒提供内部基因[11,12]。因此,H9与H10亚型AIV对家禽养殖及人类健康卫生具有重要意义。

采用传统的方法检测禽流感病毒存在病毒分离培养周期长的缺陷，且需要血清学方法鉴定,而血清学方法则要用到较多的标准阳性血清,但是禽流感病毒不同亚型血清相互之间又存在不同程度的交叉免疫保护反应,其结果的准确性具有局限性,所以目前禽流感病毒较多的采用分子生物学方法进行检测[13]。分子生物学方法特别是RT-PCR检测技术具有快速、简便和准确等优点,在禽流感的诊断及大规模监测过程中应用广泛[14]。由于AIV感染动物后具有相似的临床症状,混合感染的现象也普遍存在,所以在日常诊断中难以及时准确地对其进行鉴别确诊。近年来,随着分子生物学技术的发展,多重PCR技术的应用也越来越多,特别是在禽流感诊断领域,但关于三重RT-PCR检测区分H9与H10亚型AIV混合感染的方法还未见报道。鉴于此,本研究建立了一种可同时检测H9与H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法,不仅可以快速准确地鉴别两种不同亚型AIV,有利于畜牧业的健康发展,同时也可为感染人的AIV病原学监测提供技术支撑,具有十分重要的公共卫生意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 毒株 AIV毒株H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV、ARV及ILTV均由广西兽医生物技术重点实验室保存;AIV毒株H7N2、H14N5、H15N9和H16N3的cDNA模板由美国宾夕法尼亚州立大学惠赠;AIV毒株H5N2的cDNA模板由美国康涅狄格州立大学惠赠;AIV毒株H2N3、H4N5、H7N2、H8N4、H10N3、H11N3、H12N5和H13N5的毒株或cDNA模板均由香港大学惠赠。

1.1.2 试剂 本实验所用SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。DL1000 DNA Marker、感受态细胞、PCR产物快速连接载体、胶回收试剂盒及小量质粒抽提试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。MLV逆转录酶、随机引物、10 mmol/L dNTP、RNA抽提试剂盒、2×PCR Mix及RNA抑制剂均购自宝生物(北京)有限公司。其它试剂均购自商业公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物的设计及合成 从GenBank中下载已经发表的各种不同亚型禽流感病毒的M基因序列、H9和H10亚型AIV的HA基因的全长序列；应用DNAStar软件对所下载的序列进行比对分析,找出各个基因的特异性保守区域,用Primer Premier 5.0软件进行引物设计,同时结合Oligo 7分析软件对引物进行评价；将设计的引物进行BLAST验证并进行筛选,选出3对针对M基因、H9和H10亚型AIV HA基因都特异且片段大小合适的引物。引物由宝生物(大连)有限公司合成。引物序列及目的片段大小见表1。

表1 禽流感病毒H9、H10亚型HA和M基因的引物序列

1.2.2 病原RNA/DNA的提取与cDNA合成 参照核酸抽提试剂盒使用说明书，对本研究中所用到的AIV、IBV、NDV和ARV的RNA及ILTV的DNA进行抽提,抽提后的核酸模板用33 μL RNA-free水溶解。RNA模板参照宝生物反转录试剂盒的说明书进行cDNA的合成,将所有核酸模板置于-30 ℃低温保存备用。

1.2.3 三重RT-PCR反应体系的建立及优化 该方法应用25 μL反应体系:2×PCR Mix 12.5 μL、H9与H10亚型AIV cDNA模板各1 μL；引物M-F、M-R、H9-F、H9-R、H10-F和H10-R (20 pmol/μL)分别加入0.1～1.0 μL,共10个梯度,每个梯度递增0.1 μL,进行3个引物组合浓度的优化,最后用RNA-free补足至25 μL。同时根据浓度实验的效果再对退火温度及反应时间进行组合优化,最终确定该方法最佳的反应体系及条件。

1.2.4 特异性实验 应用上述所建立的三重RT-PCR检测方法，分别对H1N2、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H6N2、H7N2、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N3、NDV、ARV、IBV和ILTV的cDNA/DNA进行检测,验证所建立方法的特异性。

1.2.5 标准品的制备 参照文献[15]中HA全长基因的引物,分别以H9N2与H10N3毒株的cDNA为模板，进行M基因和HA基因的RT-PCR扩增,得到其全长目的片段,并将目的片段分别连接到载体上并送公司进行测序。将插入有H9与H10亚型AIV的HA基因和M基因全长片段并测序正确的重组质粒分别命名为M-T、H9-T和H10-T。用商品化的质粒抽提试剂盒分别提取含有M-T、H9-T和H10-T的质粒,并用微量核酸检测仪对其浓度进行测定,根据相关公式计算样品相对应的拷贝数；同时将M-T、H9-T与H10-T质粒等拷贝数混合,并将混合好的样品进行10倍的倍比稀释,以便获得M-T、H9-T与H10-T质粒DNA浓度均为(5×107)～(5×102)拷贝/μL的标准品。

1.2.6 敏感性实验 应用上述已优化的三重RT-PCR检测方法，对制备的浓度为5×109至5×101拷贝/μL的M-T、H9-T与H10-T质粒样品进行扩增,验证该检测方法的敏感性。

1.2.7 临床样品检测 应用本实验所建立的三重RT-PCR检测方法，对近期从活禽市场采集的152份鸡和鸭咽喉及泄殖腔棉拭子样品的一部分进行PCR检测鉴定；同时将相同编号的剩余样品经过处理后接种SPF鸡胚，进行流感病毒的分离与血清学鉴定,并将鉴定H9与H10亚型AIV为阳性的样品进行HA基因的序列测定,对所有M基因阳性样品也进行序列测定。然后将上述方法的检测结果进行对比,进而验证三重RT-PCR检测结果的准确性。

2 结果与分析

2.1 三重RT-PCR反应条件的优化

通过对M基因、H9与H10亚型AIV HA基因3对特异性引物浓度比例及扩增温度、时间等的优化,确定三重RT-PCR反应的最佳体系为:2×PCR Mix 12.5 μL；H9与H10亚型AIV cDNA共2 μL作为模板；特异性引物M-F和M-R (20 pmol/μL)的加入量为0.6 μL；特异性引物H9-F和H9-R (20 pmol/μL)的加入量为0.7 μL；特异性引物H10-F及H10-R (20 pmol/μL)的加入量为1 μL；用RNA-free水补足至终体积25 μL。通过对退火温度进行梯度优化筛选,确定该反应体系的最佳退火温度为53 ℃。

2.2 特异性实验结果

用所建立的三重RT-PCR方法从H9及H10亚型AIV混合样品分别检测出3条特异性的条带,分别为669 bp(通用)、490 bp(H9亚型)及272 bp(H10亚型);对H9N2和H9N6亚型AIV进行PCR检测，结果仅出现2条特异性条带,片段大小分别为669 bp和490 bp;对H10N3亚型AIV进行扩增，只检测出2条特异性条带,片段大小分别为669 bp和272 bp;对其它亚型AIV进行PCR检测，只有1条669 bp的特异性条带；常见的禽病病原体均未扩增出任何条带。表明该方法具有良好的特异性。特异性实验结果见图1。

M: DL1000 DNA Marker; 1: H9N2+H10; 2: H9N6+H10; 3: H9N6; 4: H9N2; 5: H10N3; 6: H1N7; 7: H2N3; 8: H3N2; 9: H5N2; 10: H6N2; 11: H7N2; 12: H8N4; 13: H11N2; 14: H12N5; 15: H13N5; 16: H14N5; 17: H15N5; 18: H16N3; 19: IBV; 20: ARV; 21: ILTV; 22: NDV; 23: 阴性对照。

图1 特异性实验结果

2.3 敏感性实验结果

应用该方法针对(5×107)～(5×102)拷贝/μL的M基因、H9与H10亚型的AIV质粒模板进行扩增,结果显示,对浓度为(5×107)～(5×102)拷贝/μL的M基因、H9与H10亚型的AIV进行扩增，均有3条明显的特异性扩增条带出现,片段大小分别为669、490和272 bp;对浓度等于或小于5×103拷贝/μL的M基因、H9与H10亚型AIV进行扩增，均无扩增条带。由此可见,该方法最低能同时检测到质粒模板量为5×104拷贝/μL的M基因、H9与H10亚型AIV。

2.4 临床样品检测结果

应用所建立的三重PCR方法对从南宁、柳州和防城港不同活禽市场采集到的152份鸡和鸭咽喉及泄殖腔拭子样品进行检测,结果显示：有13份样品为H9与H10亚型AIV混合感染阳性,阳性率为8.55%;28份样品能扩增出490 bp的目的条带,为H9Nx AIV,阳性率为18.42%;6份样品能扩增出272 bp的目的条带,为H10Nx AIV,阳性率为3.95%;其余有18份只有669 bp的目的条带,为除H10Nx和H9Nx外的其它亚型禽流感病毒。部分活禽市场棉拭子样品PCR检测的结果见图3。上述样品检测结果与经典的鸡胚病毒分离鉴定,及其HA基因和M基因测序结果100%相符。

M: DNA标准DL1000; 1: 5×107拷贝/μL; 2: 5×106拷贝/μL; 3: 5×105拷贝/μL; 4: 5×104拷贝/μL; 5: 5×103拷贝/μL; 6: 5×102拷贝/μL; 7: 阴性对照。

图2 敏感性实验结果

M: DNA标准DL1000; 20: H10亚型AIV阳性产物; 4、13、16、18: H9亚型AIV阳性产物; 5: H9与H10亚型AIV的阳性产物; 2、7、11、14:其它亚型AIV的阳性产物;其余为阴性产物。

图3 部分临床样品的检测结果

3 讨论

自上世纪90年代H9亚型AIV在中国被发现以来,该亚型病毒已经在全国各个养殖区流行。它不仅给中国的家禽业带来了严重的经济损失[16],而且H9N2亚型AIV还可以直接感染人,迄今其直接感染人的病例还在不断出现。研究表明H10亚型AIV对家禽呈现低致病性,但是其可以跨越种属屏障直接感染人[17]。AIV的监测结果表明在我国流行的H10亚型禽流感病毒组合包括H10N3、H10N4、H10N5、H10N7、H10N8和H10N9[18]。AIV在感染宿主后,还可再次感染其它不同亚型AIV,不同亚型和来源的AIV片段在宿主体内可能会发生基因重组,进而产生新的重组毒株，包括高致病性的H5N6和H7N9亚型AIV以及感染人的H10N8亚型AIV等[19]。近年来,这些“新毒株”已经对家禽生产及人类公共卫生的安全构成了严重威胁,从而引发了国内外科学家对H9与H10亚型AIV的极大关注和深入研究。

近年来,我们持续多年对广西地区家禽中LPAIV的流行情况进行了监测,发现广西家禽中LPAIV感染比例比较高的是H9亚型AIV, H10亚型AIV也经常在鸭中被检测到,该结果与华东地区等地区LPAIV的监测结果[20-22]基本一致。由于LPAIV在家禽体内多以混合感染的形式存在,且多数病毒对家禽的致病性不强,临床症状及剖检病变极其相似,采用肉眼观察和常规的方法难以进行快速准确的鉴别诊断。H9与H10亚型AIV不仅在各种家禽中广泛流行,还不断出现直接感染人的病例,已经严重威胁人类公共卫生安全。目前,利用传统的病毒分离及血清学鉴定方法对H9与H10亚型AIV的混合感染进行检测，不仅耗时而且准确性也难以保证,迫切需要建立一种能够在较短时间内快速有效地检测及鉴别H9与H10亚型AIV的方法。

本研究通过软件设计针对H9与H10亚型AIV HA基因及M基因的特异性引物,经过对不同引物组合进行实验筛选，得到扩增效果较好的1个引物组合；然后继续对反应体系中的引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化,最终建立了可同时检测H9与H10亚型AIV的方法。其特异性验证结果表明该方法只能特异性地扩增出H9与H10亚型AIV的HA基因及M基因,不能检测出其它亚型AIV的HA基因及其它常见家禽病原的核酸。敏感性实验结果表明该方法能检测到最低浓度为5×104拷贝/μL的3种质粒的模板。另外,对从不同地区采集的152份临床样品的检测结果也表明其结果与病毒分离及测序结果完全相符。综上所述,本研究已经成功建立了一种能够同时检测H9与H10亚型AIV的三重RT-PCR方法,1次PCR反应便可同时确定样品中H9与H10亚型AIV的混合感染及单一感染情况；该方法还具有特异性强、快速简便及易于操作等优点,十分适于在基层单位应用推广,可为H9与H10亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。