张 婷，郭勤卫，刘慧琴，李朝森，章心惠，崔文浩，项小敏，赵东风

(衢州市农业科学研究院，浙江 衢州 324000)

辣椒属于茄科辣椒属，是一年生或者多年生的草本植物，果实形状、大小各异，一般为辣或甜味。它广泛种植于热带和温带地区，对温度较为敏感[1]。低温会导致生长发育迟缓，随着辣椒周年生产和周年供应技术的出现，早春和晚秋的种植模式容易遇到低温，尤其是冬春保护地生产中，低温成为主要制约辣椒生长发育的关键因素，培育耐低温的品种一直是我国辣椒抗逆育种的主攻目标之一，辣椒材料耐冷性的比较与筛选为选育耐冷的优异育种材料奠定了物质基础，对辣椒栽培与推广具有深远的指导意义。

辣椒材料耐低温能力的鉴定一般分为直接鉴定法和间接鉴定法，田间鉴定法可通过直接观察植物遭遇自然低温后外在形态的变化来评价和鉴定其耐冷性，但试验过程中极易受到环境中其他不可控因素的影响，试验周期也相对较长[2]。间接鉴定法是指人工模拟低温环境，分析与耐冷性相关的指标参数变化来反映其耐冷性。有研究表明：通过测定与植物耐低温有关的生理生化指标可以间接评价植物的耐冷能力，如可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素含量、膜透性、氧化还原性酶活性等[3-10]。张茹等[8]发现辣椒幼苗在5 ℃低温处理后，其电导率升高、叶绿素含量均降低、可溶性蛋白含量增加；王慧等[9]研究发现低温胁迫后，辣椒叶绿素含量降低、可溶性糖含量和脯氨酸含量增加、POD和SOD活性升高。与此同时，也有研究人员采取直接鉴定法，丁梦佳等[11]对44份辣椒材料进行苗期和成株期的耐冷性鉴定，发现1份耐冷辣椒材料。此外，还有研究人员针对辣椒耐冷机理[12-14]、耐冷材料的筛选方法[15]、辣椒萌芽期耐冷性[16-18]等方面开展了相关研究。但是关于辣椒耐冷性的生长指标和生理生化指标的主成分分析报道较少，利用隶属函数法分析辣椒材料的耐冷性也未见报道。本试验通过研究前人认为与植物耐冷性有关的生理生化指标6个，包括可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量、SOD酶活性、POD酶活性、膜透性和叶绿素含量(SPAD值)，以及人工接种鉴定后的冷害指数，对7个指标进行主成分分析，最终通过隶属函数分析对其耐冷性进行综合评价。隶属函数法是可以将定性评价转化为定量评价，采用多指标分析植物受到胁迫后的响应进行综合评价，利用该方法综合评价植物抗逆性的强弱，避免了利用单一生理指标对辣椒材料进行耐冷性评价的片面性[19-20]。

1 材料与方法

1.1 材料

2个辣椒品种为玉龙椒和衢椒3号，9个辣椒材料分别为Y801、L11-3-2-1-1、金5-8、05B03、B1-2、L19-1-1-1-1、L11-2-1-1、05B11、B15-4-6，所有材料均来自于衢州市农业科学研究院蔬菜所资源圃。

1.2 方法

1.2.1 试验材料培养 试验在衢州市农科院实验室进行。2018年3月9日进行浸种催芽，每个材料(品种)选取饱满的种子100粒，采用温汤浸种后用0.1%高锰酸钾溶液处理15 min，用自来水冲洗干净后放入28 ℃恒温箱中催芽。出苗后移至营养钵进行培养，育苗期间进行常规管理直至幼苗长到4叶1心。每个品种挑选健壮、长势一致的60株幼苗进行试验，每个处理10株，共3个重复，并设有空白对照。

1.2.2 试验材料处理 将处理材料放置在8 ℃/5 ℃的人工气候箱低温处理3 d，光照强度2000 lx，昼夜时长均为12 h，以25 ℃/15 ℃下的植株为对照。3 d后观察辣椒冷害情况，按照徐伟慧等[5]的冷害分级标准进行冷害分级鉴定，并按照公式冷害指数=∑(各级株数×级数)/(总株数×最高级别数)计算各材料的冷害指数。分别取处理后和对照的辣椒植株的功能叶片作为测定叶片膜透性、MDA含量、可溶性蛋白含量、叶片SPAD值、超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性的样品。

1.2.3 指标测定 叶片膜透性采用电导仪法进行测定；叶片丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定；叶片可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定；叶片SPAD值采用SPAD-502叶绿素计测定；叶片SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定；叶片POD活性采用愈创木酚法测定。所有指标测定均设置3个重复，数据处理结果均为3个处理的平均值。

1.3 数据处理

采用Excel 2016对数据进行处理，采用Duncan’s新复极差法比较不同处理组数据的差异，用SPSS 19.0软件分析不同指标间的相关性和主成分。并用模糊函数法进行分析[21]，以隶属函数值对低温胁迫下的供试材料进行综合评价，具体方法参照文献[21]，运用的主要公式如下：

(1)隶属函数值:

公式中，Xa表示第a个因子的得分值，Xmin表示第a个因子得分的最小值，Xmax表示第a个因子得分的最大值。

(2)综合评价

公式中，Di为材料在盐碱地用综合指标评价所得的辣椒苗期耐冷性综合评价值，k为样品个数。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对辣椒幼苗生理生化指标的影响

2.1.1 可溶性蛋白 由图1A可知，对照中不同的辣椒材料可溶性蛋白含量差异较大，含量最高的是L11-3-2-1-1，其次为B1-2，而低温处理后可溶性蛋白含量均明显升高。除L11-3-2-1-1外，其余均与对照达到显著性差异，其中可溶性蛋白含量最高的是B1-2，其次为05B03和Y801。仅从可溶性蛋白含量来看，耐低温性最好的是Y801，最差的是L11-3-2-1-1。

2.1.2 SPAD值 由图1B可看出，各辣椒材料的SPAD值以B1-2材料的最高，其他材料差异不大；低温处理后不同辣椒材料的SPAD值均低于对照，呈下降趋势，其中B1-2的降幅最大，达47.78%，与对照差异性显著；衢椒3号与对照差异最小，仅比对照降低10.09%。仅从SPAD值来看，耐低温性最好的是衢椒3号，最差的是B1-2。

小写字母表示对照中不同材料间差异显著(P<0.05)，*表示各材料的对照与低温处理差异显著(P<0.05)。下同。

2.1.3 叶片MDA含量 由图2A可看出，对照中不同品辣椒材料的MDA含量有差异，但并不大，在4.7～6.45 μmol/g之间，最大的为B1-2，最小的为Y801。低温处理后不同辣椒材料的叶片MDA含量均呈现上升的趋势，但是变化幅度差异较明显，其中增幅最小的是B1-2，比对照增加2.03%，增幅最大的是B15-4-6，比对照增加1.6倍，表明在低温胁迫下，B1-2、Y801、05B03还能保持较低的MDA水平。

2.1.4 叶片膜透性 由图2B可看出，对照中不同辣椒的膜透性差异并不明显，均在20%左右，表明所有材料均处在相同的环境条件下，并且培养环境比较适宜辣椒材料生长。低温胁迫后，不同辣椒材料的膜透性变化差异较大，都出现了不同程度的上升，并且低温处理后的膜透性均与对照有显著性的差异，其中增幅最大的是Y801，比对照增长2.05倍；增幅最小的是衢椒3号，仅比对照增加1%，说明衢椒3号在低温情况下仍然可以保持较低的膜透性，其耐低温性较强。

图2 低温胁迫对不同辣椒材料的MDA含量和膜透性的影响

2.2 低温胁迫对辣椒苗抗氧化酶活性的影响

2.2.1 SOD活性 由图3A可看出，对照中不同辣椒材料的SOD活性差异比较明显，表明不同材料中SOD酶活不同。对照中SOD活性最强的是05B03，最弱的是B1-2；低温处理后大部分辣椒材料的SOD活性有所增强，期中衢椒3号、玉龙椒、L11-3-2-1-1等3个材料仅有略微的上升，而金5-8和Y801增幅最大，并显著高于对照，金5-8和Y801在低温胁迫后SOD活性明显增强。

2.2.2 POD活性 由图3B可看出，对照中不同辣椒材料的POD活性差异并不显著，均在500 μ/g FW左右，其中POD活性最强的是衢椒3号；低温处理后不同辣椒材料的POD活性明显增强，并达到显著性差异。其中05B03和衢椒3号的POD活性增强最明显，分别比对照增加4.4倍和3.8倍。相比较而言，低温胁迫后辣椒植株内的活性氧迅速积累，可以看出POD的活性变化幅度明显高于SOD活性变化幅度，表明在清除活性氧的过程中POD酶的作用比SOD酶的作用大。

图3 低温胁迫下不同辣椒材料的SOD和POD活性的影响

2.3 低温胁迫下辣椒的冷害指数

从表1可以看出，不同辣椒材料的耐冷性差异明显，耐冷指数最小的是B1-2，最大的为B15-4-6。根据耐冷指数分级，耐低温材料有2份，分别为B1-2和衢椒3号，Y801、05B03、玉龙椒为中等耐低温材料，剩余6份为不耐低温材料。

2.4 隶属函数法对低温胁迫下辣椒苗期的耐低温性的综合评价

2.4.1 耐低温系数分析 耐低温性是一个复杂的数量性状，单一的研究指标不能表示品种的耐低温能力，该研究综合辣椒耐低温相关研究中的指标分析，从中选取低温处理后变化幅度较大的生理指标作为主要分析指标。通过耐低温系数法，用相对值消除品种自身的固有差异，其中耐低温系数=样品测定平均值/对照平均值×100%，7个指标的耐低温系数如表2所示。

表1 不同辣椒材料的冷害指数比较

表2 供试材料单项指标的耐低温系数

2.4.2 主成分分析 由表3、表4可知，对11个辣椒材料低温胁迫下的7个指标的耐低温系数进行主成分分析，提取出3个主成分，其中第一主成分(F1)主要包括膜透性、可溶性蛋白含量2个指标，2个指标代表了总指标的37.233%信息；第二主成分(F2)主要包括MDA含量、SPAD值和冷害指数3个指标，代表了总指标21.670%的信息；第三主成分(F3)包括SOD活性和POD活性2个指标，代表了总指标17.24%的信息。这3个主成分可代表所有7个指标的76.145%的信息。

表3 主成分分析

表4 方差旋转因子的载荷矩阵

2.4.3 耐低温相关性分析及综合评价 采用D值对低温胁迫下11个辣椒材料苗期的耐冷性的7个指标进行综合评价，D值越大，辣椒的耐低温性越强。结果如表5所示，低温胁迫下11个辣椒材料耐低温性D值排序为：Y801>衢椒3号>05B03>L19-1-1-1-1>B1-2>金5-8>B15-4-6>L11-2-1-1>L11-3-2-1-1>玉龙椒>05B11。

对11个辣椒材料耐冷性的7个指标和综合指标D值进行相关性分析，结果显示(表5)，辣椒材料苗期的MDA含量与冷害指数呈显著正相关(P<0.05，下同)，相关系数为0.646，说明当辣椒遭遇低温时，丙二醛含量增高，耐低温能力越弱，丙二醛积累越多，冷害症状明显，冷害指数越大。可溶性蛋白含量与膜透性呈显著正相关关系，相关系数为0.695，低温胁迫后可溶性蛋白含量增加，膜透性增加。冷害指数与D值呈显著负相关，相关系数为-0.661，说明冷害指数越小的，D值越大，冷害指数可作为筛选耐低温辣椒材料的可靠参考指标。

表5 隶属函数值及综合排名

表6 指标相关性分析

注：*表示在5%水平上的差异显著性。

3 讨论

3.1 低温胁迫对辣椒生理生化指标值的影响

前人研究发现辣椒遭受低温胁迫后，辣椒叶片的膜透性明显高于对照，可溶性蛋白、可溶性糖等渗透调节物质会大量积累，SOD酶和POD酶的活性明显高于对照，植物光合作用能力减弱，叶绿素含量降低，SPAD值减小[6,8-11]。本研究结果中叶片中可溶性蛋白、MDA含量、SPAD值、膜透性、SOD酶活性与POD酶活性等的变化趋势与前人研究结果相似，在低温胁迫后辣椒幼苗叶片的可溶性蛋白含量明显高于对照，叶片的SPAD值明显小于对照，膜透性变大，SOD酶活性、POD酶活性均高于对照，并且不同辣椒材料间升高或降低幅度差异较大。产生这一系列变化的主要是由于低温环境首先引起细胞膜的主要构成物质——脂类由液晶态变为凝胶态，导致细胞膜的选择透过性变大，细胞内的可溶性物质外渗，导致电导率增大。植物为了防止从细胞质中吸水会产生更多的渗透调节物质如可溶性糖、可溶性蛋白等物质来平衡渗透式，因此可溶性蛋白、可溶性糖含量等渗透调节物质在低温胁迫后升高。其次，低温环境会引起植物体内的抗氧化酶的活性降低，导致植物体内产生的活性氧不能被清除，丙二醛积累；同时刺激植物体内的保护酶如SOD酶、POD酶等活性增强，防止细胞受到氧化胁迫。低温导致辣椒的叶绿素含量降低可能是由于低温导致叶绿素合成受阻，持续低温可造成辣椒体内合成的叶绿素被分解，导致叶绿素含量降低，SPAD值减小。

3.2 辣椒材料耐冷性的综合评价

本研究采用隶属函数法并综合SPAD值、MDA含量、SOD和POD酶活性、膜透性、可溶性蛋白含量等生理生化指标及冷害指数人工接种鉴定指标进行降维处理，经过隶属函数法计算后的D值最高的是Y801，为0.597，耐冷性排名第1位。虽然低温胁迫下不同辣椒材料的膜透性与可溶性蛋白含量相关性显著，相关系数为0.695，但是两者与D值相关性不显著，但低温胁迫下各品系(种)辣椒材料的膜透性、可溶性蛋白含量均高于对照也可说明膜透性、可溶性蛋白对低温胁迫的响应，且在低温胁迫下可溶性蛋白含量最高的品系是Y801，膜透性最小的材料也是Y801，表明本研究得出的结论符合膜透性小、可溶性蛋白含量高的品系(种)耐低温性强的机理，但是膜透性与D值得相关系数极低，说明膜透性只可作为筛选辣椒苗期耐低温材料的参考指标，可溶性蛋白含量可作为重要参考指标。与膜透性相同，同一品系(种)的MDA含量、SPAD值虽然低温胁迫后均有响应，但是其影响值可能小于冷害指数，因此这些指标能否作为筛选耐低温材料的主要参考指标有待进一步验证。

在对照处理和低温胁迫下MDA含量和耐冷指数最小的是B1-2，其经过隶属函数法计算后的D值为0.525，耐冷性排名第5位，低温胁迫下不同辣椒材料的MDA含量与冷害指数的相关性为0.646，达显著水平，说明MDA含量与冷害指数呈明显正相关关系，冷害指数与D值的相关性值为0.616，达显著性水平，表明冷害指数可作为耐冷性评价的代表性指标。

低温胁迫后SOD活性最高的是金5-8，但是金5-8的D值并不高，SOD活性与D值相关性并不显著，说明SOD能否作为筛选低温材料的主要参考指标有待进一步验证；POD活性最高的是衢椒3号，且低温胁迫后所有材料的POD活性与对照均有显著性差异，衢椒3号的D值较高，排名第2位，POD活性与D值相关性并不显著，但相关系数还比较高，综合比较说明POD活性可作为筛选耐低温辣椒材料的主要参考指标。

4 结论

利用隶属函数法对11个辣椒材料的苗期耐低温能力强弱排序为：Y801>衢椒3号>05B03>L19-1-1-1-1>B1-2>金5-8>B15-4-6>L11-2-1-1>L11-3-2-1-1>玉龙椒>05B11；结合各指标的代表性值与D值的相关性，得出冷害指数可作为筛选辣椒材料苗期耐低温品种的代表性指标。