尚 静，张爱冬，张圣美，刘晓慧，查丁石，吴雪霞*

(1.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306；2.上海市农业科学院 园艺研究所，上海 201403)

植物正常的生长、发育和繁殖需要适宜的环境条件。然而，在植物生命周期中，植物体不可避免地要应对各种不稳定的非生物环境条件，包括高温、低温、干旱、盐胁迫、重金属含量过高、营养供应少和光照不足等。这些因素可能发生在植物生长的各个时期，进而限制其生长发育，甚至使植物不能完成生活史。对于农作物和园艺作物而言，这些因素更会影响其产量和品质，对农业经济造成严重损失。

在自然界中，植物经过了长期的适应与进化，形成了一系列机制以适应和抵御各种逆境胁迫[1]。转录因子在调控下游基因表达，协调信号途径间的相互作用中发挥了重要的作用[2]。随着现代分子生物学的不断发展，许多重要的植物转录因子被发现并进行了深入研究。WRKY家族是植物最大的转录因子家族之一，其调控范围涵盖植物生长发育和逆境响应等多种生理活动[2]。与生物胁迫相比，对WRKY转录因子在非生物胁迫下的功能研究起步较晚[3]，但近年来多个研究表明，WRKY转录因子在植物非生物胁迫下同样扮演着重要的角色，因此越来越受到研究者们的关注[4]。本文主要对近年来植物在非生物胁迫下WRKY转录因子发挥的功能做一概述。

1 WRKY转录因子的一般特性

1.1 WRKY转录因子的结构特点与分类

WRKY转录因子是一类与DNA结合，进而影响植物生长发育的蛋白。WRKY转录因子至少含有一段60个左右的高度保守的氨基酸序列[5]，其中靠近N末端有1个七肽WRKYGQK，具有高度保守性，故而得名。WRKYGQK作为WRKY转录因子的核心序列，Q更容易发生变异，W、K和Y是保守的[6]。在其C末端有一个锌指结构(Zinc-Finger Motif)，其一般组成为Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC型的锌指结构[7]，主要介导了WRKY转录因子与目标DNA序列的特异性结合。N末端WRKY结构域虽然不具有DNA结合活性，但可以促进C末端WRKY结构域与靶基因的特异性结合[8-9]。根据WRKY结构域的数目和锌指结构特征，可将WRKY家族分为3个亚家族：第Ⅰ亚家族含有2个WRKY结构域，第Ⅱ亚家族含有1个WRKY结构域和C2H2型锌指结构，第Ⅲ亚家族含有1个WRKY结构域和C2HC型锌指结构[10]。其中第Ⅱ亚家族又根据氨基酸核心序列不同，被细分为5个亚组。

亮氨酸拉链(Leucine Zipper,LZ)是某些WRKY转录因子常见的氨基酸结构域之一。这类转录因子有一段特殊的α螺旋，在此类α螺旋中频繁出现亮氨酸且出现在α螺旋同侧，直线排列成一条疏水带，2个转录因子就靠各自疏水带间的疏水相互作用结合到一起，形成同源或异源二聚体即为亮氨酸拉链[11]。亮氨酸拉链本身并不与DNA结合，而是通过其氨基端上一段碱性区来与序列结合，若含亮氨酸拉链的转录因子未形成二聚体，碱性区对DNA的亲和力将会明显下降。因为此类转录因子与DNA结合是以其碱性区和亮氨酸拉链结构作为整体来发挥作用的，所以此类结构又经常称为碱性亮氨酸拉链(Basic-Leucine Zipper)。

除此之外，大部分WRKY转录因子还具有脯氨酸富集区、谷氨酸富集区、丝氨酸/苏氨酸富集区、激酶结构域和TIR-NBS-LRRs等结构[12]，这些结构的存在使得WRKY转录因子在控制基因表达时能扮演多重角色。

1.2 WRKY转录因子的起源

WRKY转录因子主要存在于高等植物中。根据已公开的WRKY基因序列，编码2个WRKY结构域的部分基因序列是从原生真核生物蓝氏贾第鞭毛虫、盘基网柄菌和衣藻中拷贝而来[12]，这为WRKY转录因子的进化提供了依据。在以上3个亚家族中，第Ⅰ亚家族通常被认为是WRKY转录因子的祖先。随着WRKY保守结构域的丢失，产生WRKY转录因子的第Ⅱ亚家族；因植物生存的需要，WRKY转录因子C端锌指结构在第Ⅱ亚家族的基础上发生突变，形成了第Ⅲ亚家族[2]。

1.3 WRKY转录因子的作用途径

1.3.1 与目标DNA结合 在所有研究过的可能受WRKY转录因子调节的基因的启动子中，都能发现(T)TGAC(C/T)序列，称为W-box[13]。WRKY转录因子通过特异性地与靶基因启动子W-box顺式元件相结合，在级联反应中充当转录激活剂或抑制剂[9]。水稻OsWRKY47能够与启动子区的顺式作用元件直接结合，以正向调控水稻抗旱[14]。

1.3.2 与蛋白质互作 WRKY转录因子可以通过与不同蛋白间的相互作用，来实现其在不同逆境胁迫中相应的应答功能。如：酵母双杂交实验表明拟南芥AtWRKY40和AtWRKY60蛋白，AtWRKY36和AtWRKY38蛋白之间互作[15]。VQ蛋白多次被报道作为WRKY蛋白的共同作用因子参与到基因表达调控中[16]。Hu等发现AtWRKY8与VQ9通过相互拮抗调控植物的耐盐性，盐胁迫使得AtWRKY8基因表达量上调，突变体则表现出对盐敏感的表型，相反vq9突变体则表现出耐盐性[17]。李琪等在对拟南芥的研究中发现，WRKY72可能与自身及一些近源WRKY转录因子互作,以多聚体的形式发挥其转录抑制子的功能,并参与特定的非生物胁迫相关的信号转导过程[18]。值得一提的是，WRKY转录因子还可以结合到自身启动子序列的W-box上，进行自调节和交叉调节。染色质免疫沉淀(ChIP)研究显示PcWRKY1能结合其自身以及PcWRKY3启动子的W-box[19]。

1.3.3 参与调控信号网络 非生物胁迫会诱导WRKY转录因子并触发信号传递网络以改善植物的抗逆性[13]。研究表明，MAP激酶级联系统会响应外界环境信号，MAP激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)通过修饰一些WRKY蛋白来调节它们的功能。MAPK是近年来被广泛研究的信号转导分子，该系统由MAPK、MAPK激酶(MKK)和MAPKK激酶(MEKK)构成(图1)。外界信号经过该系统可被逐步放大并传递到细胞内，引发生化和生理反应[20]。WRKY40可以直接抑制ABA响应基因的表达，如WRKY40能够与WRKY18、WRKY60相互作用影响植物的ABA水平和非生物胁迫[21]。闫慧茹[22]研究发现，GhWRKY17超表达植株在种子萌发期和萌发后的生长对ABA敏感，但对ABA调控的气孔关闭不敏感，导致较高的失水率从而对干旱敏感，表明GhWRKY17通过ABA信号途径参与植物的干旱胁迫反应。

图1 WRKY转录因子介导的植物应答反应模式图[20]

1.3.4 迅速多向调控 WRKY转录因子基因是通过诱导表达的，不依赖于从头合成的调控因子，因此具有快速、瞬时的特点[3]。有的WRKY转录因子只受一种胁迫因子的诱导，有的却同时受多种胁迫因子诱导，如在水稻中WRKY57基因受干旱、高盐和PEG诱导，将WRKY57在拟南芥中高表达可显著提高其对上述3种逆境的耐受性[23]。同一种胁迫也可能诱导多种WRKY转录因子表达。如Insaf等在对南瓜WRKY基因的研究中发现，24个CmWRKY基因对水分条件有反应，其中3个基因会在缺水条件下上调[24]。一个转录因子可能对应多种逆境，一种逆境也可能对应多个WRKY转录因子，如此形成一个网状调控系统，体现出植物调控非生物胁迫相关基因过程的复杂性和多样性。

2 非生物胁迫下WRKY基因的功能

植物在生长过程中，要应对不断变化的外界环境。当环境条件超出植物能承受的区间，就会发生逆境胁迫。在逆境条件下，植物的生理生化过程会发生相应的改变。逆境胁迫可以分为生物胁迫和非生物胁迫两大类，非生物因素对植物性状的影响较生物因素更为显著[25-26]。近年来有研究表明，WRKY转录因子在温度胁迫、水分胁迫、盐胁迫等非生物逆境中起到了重要的调控作用。

2.1 温度胁迫

温度在植物生长发育过程中起着非常关键的作用,当环境温度超出了植物的适应范围,就会对植物形成胁迫,温度胁迫分为高温胁迫和低温胁迫，都对植物的生长不利[27]。温度胁迫被认为是一个重要的非生物胁迫，它会影响植物光合作用、氧化还原反应、细胞膜流动性、细胞渗透压、蛋白质和核酸的结构等生理和代谢反应等[28]。对植物而言，高温和低温都是限制其生长发育的主要不利因素。大量相关研究工作揭示了WRKY转录因子参与了植物响应高温胁迫和低温胁迫[29-30]。

高温胁迫会损伤细胞膜并打破植物体内的活性氧平衡等，影响植物的结构和功能[31]。同时高温还会抑制类囊体的活动，尤其是光系统Ⅱ的反应中心[32]。孔倩倩[33]在对文心兰高温处理后12 h发现OnWRKY1表达量升高，说明OnWRKY1是一个与抗热相关的转录因子。Dang等[34]研究发现,辣椒叶片的CaWRKY40基因受高温诱导后表达会显著上调。申磊[35]在研究CabZIP63和CaWRKY40两个转录因子时发现，前者可以结合后者基因的启动子，在对高温高湿胁迫下的应答过程中，这种结合会被加强。

低温胁迫也会导致植物光合作用效率下降，植物在受到低温胁迫后，首先伤害的是细胞膜系统，进而对植物光合色素含量、叶绿体亚显微结构、光合能量代谢、PSⅡ活性以及一系列重要生理生化过程都产生影响，最终出现植株损害严重或者死亡[36-37]。袁玉辉等[38]在对芥菜型油菜转录因子BjWRKY33的研究中表明，冷害(4 ℃)会诱导叶片中BjWRKY33基因表达量升高。小金海棠中MxWRKY基因在低温处理(2 ℃)下也会被诱导上调表达[39]。在低温胁迫条件下，8个茶树WRKY转录因子在处理72 h内显著上调后又显著下降，总体呈上升趋势[40]。在低温条件下，VaWRKY33过量表达的葡萄愈伤组织显示出比空载体愈伤组织更低的低温放热值，这表明VaWRKY33可以增强葡萄愈伤组织对冷的耐受性[41]。Zheng等[42]在辣椒中挑选了16个WRKY基因进行研究，发现大多数WRKY基因在冷胁迫下上调，CaWRKY6和CaWRKY42在低温胁迫下被诱导表达，且在处理后6和3 h分别达到峰值。

2.2 水分胁迫

水分胁迫对植物造成伤害主要是因为土壤水分供应不足，从而使植物叶片相对含水量及水势降低，且使气孔开度降低，从而影响呼吸作用、光合作用和正常生长发育[25]。WRKY基因在植物中的过表达对抗旱性的影响已经有了广泛的研究[43]。He等[44]在拟南芥中过表达TaWRKY33发现，当植株受到干旱胁迫时，其叶片失水率较野生型拟南芥低。Liu等[45]研究发现，将PbrWRKY53在烟草和乌苏里梨中的过表达，可以增强两者对干旱胁迫的耐受性，转基因植株表现出比野生型植株更高的含水率、抗氧化酶活性和代谢物含量，更少的活性氧成分。

2.3 盐胁迫

盐胁迫会导致渗透效应和盐的特异性效应，从而对植物造成伤害[46]。张惠媛等[47]发现，TaWRKY33会受盐胁迫的诱导表达，转入拟南芥和小麦后均能提高两者的耐盐性。石文艳[48]从大豆中克隆得到的GmWRKY12在拟南芥中过表达后发现，过表达的拟南芥的根长在NaCl处理下比对照的长、叶面积也更大，表明GmWRKY12提高了拟南芥的耐盐性。NaCl处理3个转GbWRKY32基因烟草种子和本生烟草种子，前者种子萌发率、全苗长、根系、干重、鲜重均明显高于后者，证明GbWRKY32基因可以提高烟草对盐胁迫的抵御能力[49]。

2.4 其他非生物胁迫

营养元素是植物生长的物质基础，既可以作为植物体组成成分，又可以调节植物生理功能，直接参与并且协调作物的新陈代谢以及各种生理循环，因此在很大程度上限制着作物的产量以及品质[50]。磷是植物体内核酸、磷脂和ATP的重要组成部分,参与植物体内能量代谢、酶促反应、糖分代谢、光合作用等生理生化反应[51]。因此，植物对磷素的吸收能力成为其生长发育的关键制约因素。柱花草StWRKY45基因在受低磷胁迫诱导时表现出高表达，推测StWRKY45基因可能参与柱花草对低磷胁迫的响应[52]。曾铭等[53]用qRT-PCR试验证明杉木在低磷胁迫下，ClWRKY8、ClWRKY21、ClWRKY24、ClWRKY35的表达量上调，表明这4个基因可能参与调控杉木对盐胁迫耐受力。

丝瓜在采后储藏和鲜切后,由于细胞呼吸作用产生过多的自由基而导致膜脂过氧化，从而使其细胞膜产生破裂，酚类物质、酶和氧气三者发生接触并导致组织褐变,影响其感官品质和商业价值。刘建汀等[54]研究丝瓜鲜切后WRKY基因表达量变化发现，0～6 h内丝瓜的4个WRKY基因表达量变化趋势均呈上调趋势，6 h后表达下调，但趋势总体上调。

3 问题与展望

种种研究表明，WRKY转录因子在调控植物抗逆性方面发挥着巨大的作用。在非生物胁迫下，植物WRKY类转录因子通过与目标DNA结合，与相关蛋白互作，参与调控信号网络，形成了多样且复杂的网状调控系统。已报道的WRKY转录因子主要着眼于一个转录因子功能的研究，或与另一个蛋白之间的互作关系，对WRKY转录因子在调控网络中串扰机制尚未有整体把握。此外，内外部刺激信号如何逐步传递给WRKY蛋白，WRKY家族成员间互作如何影响植物各种生理生化反应，WRKY转录因子核心序列的变异是否影响目的基因功能的改变等还不完全清楚，因此还需要进一步深入探究和完善。

随着生物信息学、基因组和转录组学、蛋白组学的发展，越来越多植物WRKY转录因子家族的神秘面纱被揭开。模式植物和一些植物基因组测序的完成为研究WRKY基因的表达和功能提供了条件，基因工程技术为作物遗传改良提供新的途径，也提高了培育植株抗逆新品种的效率。