赵 南，王松涛，刘庆国，邹亚男，陈 勇

(1.南京高新工大生物技术研究院有限公司，江苏 南京 210032；2.泸州品创科技有限公司，四川 泸州646000；3.南京工业大学，江苏 南京 211816)

虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素，具有抑菌、抗肿瘤、免疫调节和抗炎症等生物学活性，由一个3-脱氧的核糖和腺嘌呤通过糖苷化连接而成。虫草素有化学法和生物法两种合成方法，其中化学合成工艺主要是以腺苷为原料，通过将腺苷的3′-位羟基溴代，再用自由基还原去除3′-位的溴制备虫草素。化学合成虫草素的过程中副产物较多，分离纯化的难度较大，因此目前虫草素合成多采用生物法[1]。

蛹虫草是生物法制备虫草素重要的菌株之一。传统的生物法制备是人工子实体固态培养，发酵工艺规模性体量大，耗时耗力，单位空间产量较低[1]。另一种生物合成的方法是通过液态浅层发酵，采用液体发酵技术培养蛹虫草菌丝体，其菌丝体生长迅速，生产周期短，虫草素产量高，提取工艺较为简单。此发酵工艺是目前大规模生产虫草素的主流方法[2]。

液体发酵法生产虫草素最为关键的因素是菌株活性。传统菌株筛选法是以菌落形态或目标产物浓度为指标，采用大量平板培养或摇瓶发酵培养进行筛选，存在劳动量大、周期长和成本高等缺点[3]。高通量筛选技术具有自动、微量和高效等优点，已广泛应用于微生物菌株选育，大幅提高了高产菌株筛选效率[4-7]。目前蛹虫草诱变方法研究较多，如硫酸二乙酯(DES)[8]和氯化锂(LiCl)[9]等化学诱变和γ射线诱变[10]、离子束诱变[11]、原生质体紫外(UV)诱变[12]等物理诱变；另外也有不少复合诱变，如 UV-DES(硫酸二乙酯)[13]、LiCl-UV[14]和60Coγ-UV[15]等。但鲜见有关高通量筛选和复合诱变技术相结合选育虫草素高产菌株的研究报道。另外，由于蛹虫草发酵温度较低，能耗较大，发酵周期仍较长，虫草素产率不理想，严重制约了其大规模生产。因此，本文利用紫外-常压室温等离子体复合诱变提高蛹虫草正突变概率，通过多孔板高通量筛选提高虫草素高产蛹虫草菌株筛选效率，并采用温度梯度驯化获得耐高温的高产虫草素菌株，以期为蛹虫草高产菌株的选育提供一种高效的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料与器材

蛹虫草CICC 14014，购自工业微生物保藏中心。Cellulase购自Solarbio 公司(日本) ； 蜗牛酶和溶壁酶均购自SIGMA；虫草素标样购自Sigma公司(美国) ；葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酵母浸粉、腺嘌呤和甘氨酸等试剂为国产分析纯；进口酵母粉和蛋白胨均为OXOID。SX-700立式全自动灭菌锅购自TOMY公司；ZQZY-CF震荡培养箱购自上海知楚仪器有限公司；SW-CJ-1BU超净台购自苏州安泰空气技术有限公司。另有GENESYS 10S UV-Vis紫外可见分光光度计、Molecular Device QPix 420 全自动菌落挑选仪、Agilent1200高效液相色谱仪(HPLC)等仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备 固体培养基：土豆汁(将200 g新鲜土豆切块，定容至1 L，煮沸30 min，过滤)、葡萄糖15 g、磷酸二氢钾2.5 g、七水硫酸镁2 g，琼脂18 g，定容至1 L。

原生质体培养基：向固体培养基中加0.5 mol/L的蔗糖。

种子培养基：葡萄糖40 g/L、蛋白胨12 g/L、酵母粉10 g/L、磷酸氢二钾0.55 g/L、磷酸二氢钾0.55 g/L、无水硫酸镁0.2 g/L，用 5 mol/L盐酸调节 pH 至 6.0。

发酵培养基：向种子培养基中加4 g/L的腺嘌呤。

1.2.2 原生质体的制备 刮取一环虫草菌丝体于固体培养基上，25 ℃培养 4～6 d，菌丝体长好后收集菌丝体。用Miracloth滤布过滤得菌丝体。刮取1勺湿菌丝体置于30 mL裂解酶液[0.6 mol/L NaCl，2%(v/v) 纤维素酶、5 g/L蜗牛酶和溶壁酶]，25 ℃、160 r/min酶解2～3 h，2 h后每隔0.5 h取样用显微镜观察，待绝大部分菌丝形成圆形结构后，用Miracloth滤布过滤收集滤液，4000 r/min离心5～10 min，弃上清得原生质体沉淀；用0.6 mol/L氯化钠漂洗2次后重悬，制得原生质体悬液，备用。

1.2.3 UV-ARTP复合诱变 用移液枪取原生质体悬液4 mL置于无菌培养皿中，在紫外(功率30 W，距离40 cm)下分别照射 0、1、2、3、4、5、6 min，然后稀释涂布于原生质体培养基平板，每个时间设置3个平行，制作致死曲线，取致死率70%的时间点作为复合诱变中紫外照射时间。取紫外照射过的原生质体悬液10 μL均匀涂布在灭菌载片表面，将装有载片的平皿转移至提前灭菌的ARTP诱变仪工作腔中。在工作功率120 W、工作气流10 SLM、照射距离2 mm条件下设置照射时间0、10、20、30、40、50、60 s。将处理过的带菌载片于1 mL生理盐水的EP管中充分混匀，稀释涂布于再生平板，每个时间设置3个平行，置于25 ℃下培养3～5 d。致死率(DR)公式：DR(%) =(C0-Ct) /C0×100%。

其中：C0为初始原生质体再生菌落数；Ct为诱变后再生菌落数，单位均为cfu/mL。

1.2.4 96孔板高通量初筛与三角瓶复筛 用全自动菌落挑选仪挑取诱变后的单菌落(复合诱变30、40、50 s的平板菌落各30个)接入装有固体培养基的96孔深孔板，于25 ℃培养5～7 d，随后转接到96孔深孔板，每个孔装1 mL的种子培养基，置于温度25 ℃、转速 210 r/min的震荡培养箱中培养3 d；再按接种量12%转接到装有发酵培养基的多孔板中，装液量同样为1 mL；然后置于25 ℃的培养箱中静置发酵28 d。根据发酵结束后虫草素测定结果，将预先保藏的对应高产虫草素菌株用斜面活化后，接入500 mL无菌三角瓶(装液量100 mL)，于 25 ℃、210 r/min 条件下培养3 d，然后按10%的接种量接入发酵培养基，于25 ℃条件下静置培养 28 d。每个菌株复筛做3个平行。

1.2.5 遗传稳定性检测 将复筛的高产突变菌株连续传代10次，每隔1代分别进行三角瓶发酵试验，测定菌体干重和虫草素产量，以评估菌株的遗传稳定性。

1.2.6 温度梯度驯化 将复筛的高产突变菌株进行涂布培养，25 ℃下培养2～3 d，挑取较大的单菌落转至新的平板，26 ℃下传代2次，进行涂布培养；挑取较大的单菌落转至新的平板，27 ℃下进行2次传代；依此进行，最终培养温度为30 ℃。每个温度水平挑取菌落进行液体浅层发酵。

1.2.7 虫草素检测方法 取发酵液样品10 mL，离心取上清液，稀释后用HPLC检测虫草素含量。色谱柱：Sepax HP-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，120 Å；检测器：紫外波长254 nm；柱温：30 ℃；流动相：甲醇∶磷酸二氢钾=25∶75；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 复合诱变

原生质体悬液经紫外辐照后，取样稀释并涂布于平板培养，根据菌落数量计算紫外诱变致死率。由图1可知，蛹虫草菌株致死率随着辐照时间的增加而提高，辐照4 min时致死率达到 80%左右；辐照5 min时致死率超过90%。研究表明，致死率与正突变呈现负相关关系，即大剂量或长时间诱变突变幅度较大，但正突变较少；而小剂量或短时间辐照诱变突变幅度较小，但相应的正突变较多[16]。近年研究发现，采用70%～80%致死率的诱变剂量效果最佳[17,18]。故本研究取照射4 min为紫外诱变时间。

紫外照射4 min后，进行ARTP诱变处理。ARTP诱变育种的原理是其发出的等离子体流作用于微生物遗传物质，对其产生强烈的畸变作用，使得微生物的基因序列和代谢网络发生较大的变异[19]。同时，具有较高活性的粒子能够改变微生物遗传物质的分子结构，而菌株SOS自动修复机制进一步提高有利突变的出现几率[20]。

由图2可知，ARTP照射30 s，致死率就达80%，50 s可达90%以上。一般复合突变效果优于单一诱变效果，为了提高筛选正突变率，将ARTP处理30～50 s的菌落作为后续初筛对象。因此选择 UV 辐照4 min后ARTP 处理 30～50 s作为初筛的诱变条件。

UV-ARTP复合诱变菌株经过96孔板发酵初筛，共挑取近300个菌落，进行多孔板种子培养和静置发酵。结果如图3所示，虫草素浓度主要集中于4～6 g/L。分别从对应的复合诱变处理30、40、50 s的高产菌株中，各取10个菌落进一步进行摇瓶发酵复筛。如表1所示，UA30-3、UA40-6、UA40-10、UA50-6虫草素产量均超过5.5 g/L，其中，UA40-6的虫草素产量达到5.98 g/L，超过出发菌株146%(出发菌株的虫草素产量为2.43 g/L)。利用96孔板和全自动菌落挑选仪相结合的高通量筛选法与传统摇瓶筛选方法相比，实验操作简单方便，大幅降低了实验人员的工作量，显著缩短了菌株筛选周期。

图1 紫外诱变致死曲线

图2 UV-ARTP复合诱变致死曲线

2.2 遗传稳定性验证

将诱变后的高产菌株UA40-6菌株进行连续传代培养，每2代分别进行种子培养和液体浅层发酵验证，结果如图4所示。蛹虫草高产突变菌株经10次传代，发酵浓度均保持在6.0 g/L左右，与未传代的突变菌株发酵水平相比，差异不显著，这与汤佳鹏和汪建雄的研究结果较为一致，结果说明复合诱变获得的高产突变株具有良好的遗传稳定性。

表1 复筛菌株产虫草素情况(选取虫草素发酵浓度大于4.5 g/L)

图3 初筛产量分布

图4 突变株UA40-6 的遗传稳定性

2.3 温度驯化

首先将菌株 UA40-6分别在25、26、27、28、29、30 ℃中进行固态培养，结果如图5所示，在26 ℃和27 ℃下菌体生长较好，28 ℃下开始出现明显异常。通过发酵验证发现(图6)，26 ℃发酵效果最好，28～31 ℃发酵的产量呈现明显下降趋势，这与李居宁的研究结果[21]较为一致。该结果说明蛹虫草对高温较为敏感。

随后将诱变菌株 UA40-6依次在26、27、28、29、30 ℃中进行温度驯化， 驯化结束后进行发酵验证。如图7所示，在28 ℃环境下虫草素产量达6.56 g/L，相比于诱变初始菌株产量提高了近10%，相比于未驯化菌株同温度下发酵产量提高了约26%。结果说明驯化后的诱变菌株活性明显提高。

图5 不同培养温度对菌体生长的影响

图6 不同发酵温度对虫草素产量影响

图7 温度梯度驯化对虫草素产量的影响

一般地，温度梯度驯化是很有效的微生物育种方法，虽然驯化过程耗时，但驯化效果较好，具有方向性好和遗传性稳定等优点[22]。通过温度驯化后的高产蛹虫草菌株在平板培养无显著变化情况下，菌株的适应温度从25 ℃提高至28 ℃，发酵产量也明显提高，这将更有利于工业化生产。

3 结论

以蛹虫草CICC14014菌株为出发菌株，经紫外和ARTP复合诱变原生质体，获得了超过50%以上高产虫草素菌株(4～6 g/L)，与出发菌株发酵产量(2.43 g/L)相比有明显提高。同时利用96孔板高通量筛选和摇瓶复筛方法获得了4株具有较高产量的虫草突变株，虫草素发酵浓度均大于5.5 g/L。在此基础上，对其中高产菌株 UA40-6进行传代培养验证，发现其遗传稳定性较强，发酵浓度维持在6 g/L左右，没有明显下降趋势。结果说明 UV 和 ARTP复合诱变并结合高通量筛选可快速获得稳定性好的高产菌株。

另外，对复合诱变菌株采用温度梯度驯化，经过10轮驯化作用，诱变菌株可耐28 ℃，相比于初始发酵温度提高了3 ℃，最终产量可达6.56 g/L，较初始发酵水平有明显提升。发酵温度的提高有利于降低生产中的冷却能耗，同时产量的提高进一步降低生产成本，对虫草素生产具有较高的应用价值。