吕丰娟,肖运萍,汪瑞清,魏林根,袁展汽,林洪鑫

(江西省农业科学院 土壤肥料与资源环境研究所/农业农村部 长江中下游作物生理生态与耕作重点实验室/国家红壤改良工程技术研究中心,江西 南昌 330200)

芝麻是我国的主要食用油料作物之一,种植面积居世界第4,总产量居世界第1。芝麻籽粒营养丰富,用途广泛,富含不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素E及人体所必需的9种氨基酸。但是,芝麻是对连作障碍敏感的作物。连作导致芝麻田土壤中速效氮、磷、钾,交换性钙、镁,以及有效锰、硼、铁、铜、锌含量下降,从而导致土壤供肥能力降低[1]。随着连作年限的增加,芝麻根际土壤中细菌和放线菌数量减少,真菌数量上升[1,2];在根区土壤中细菌、放线菌和真菌数量均显著降低,连作3年,分别下降66.1%、76.2%、56.0%,最终导致土壤微生物菌群改变、比例失调[1]。与正茬相比,连作芝麻根际土壤中青枯劳尔氏菌和尖孢镰刀菌数量升高,而有益菌群芽孢杆菌数量降低[2]。连作3年芝麻青枯病的病情指数由2.54%升高到44.75%,茎点枯病的病情指数由6.80%升高到51.63%[3]。由于以上原因,连作对芝麻产量的影响极其严重。连作1～3年,芝麻的单株蒴数下降8.41%～20.85%,单蒴粒数下降7.32%～18.16%,千粒重下降4.69%～14.72%,单株产量下降11.86%～44.07%[1],芝麻单产降低14.0%～64.4%[3]。连作障碍已经成为制约芝麻产业发展的一大重要因素。连作障碍由多种因素所致,大体可概括为:土壤理化性质恶化、土传病害以及自毒作用三个方面[1-5]。目前,已有关于连作对芝麻产量[6,7]、病害发生[6-8]和土壤理化性质[6]等方面影响的研究报道,但鲜见有连作芝麻自毒物质和自毒作用的研究报道。

化感作用是指植物或者微生物向环境中释放某些化学物质而有利或者不利于其他有机体生长发育的现象[9]。当受体和供体属同种或同科植物时产生抑制的现象,即为植物的自毒作用。根系分泌物的自毒作用可能是导致连作地土壤衰退的原因之一[10],而酚酸类物质被公认为根系分泌物中最主要的化感物质,对连作植物造成不利影响[11-13]。前人已经从多种植物的根系分泌物中提取到化感物质,可对同茬或下茬同种或同科植物产生抑制作用。结果表明,不同植物、同一植物不同品种,甚至同种植物在不同生境、不同生育期,其根系分泌物中化感物质的种类和含量均有显著差异[14-20]。那么,芝麻根系分泌物中的酚酸类物质有哪些？其在不同连作抗性芝麻品种间有何差异？其对芝麻本身有无自毒作用？均鲜见报道。鉴于此,本研究利用盆栽试验,选取3个不同连作抗性的芝麻品种,收集在正茬和连作条件下芝麻花期的根系分泌物,利用高效液相色谱法(HPLC)对芝麻根系分泌物中的酚酸类物质的含量进行测定,以探讨连作对不同芝麻品种根系分泌物中化感物质组成和含量的影响,并从自毒效应方面探明芝麻连作障碍的可能机理。

1 材料和方法

1.1 根系分泌物的收集

盆栽试验在江西省农业科学院园艺所进行,设置正茬和连作两种试验处理。正茬和连作处理所用土壤均为红壤,取自江西省农业科学院东乡试验基地,正茬处理所用土壤近5年内未种植过芝麻,连作处理所用土壤为去年种植过芝麻的土壤。供试品种为赣芝9号、金黄麻和玉山黑芝麻。其中,金黄麻为耐连作品种,玉山黑芝麻为中等耐连作品种,赣芝9号为不耐连作品种[21]。试验于2016年7月2日播种,每个处理播种6盆,每盆留苗3株。

试验于芝麻花期(2016年8月17日)对正茬和连作处理的芝麻进行根系分泌物收集,尽量保证根系不受伤害。先抖落掉大土块,之后用清水冲洗根系上附着的泥土,洗净后再用去离子水冲洗3遍,进行水培试验,并用气泵向营养液中通气,每2天更换一次营养液,1周后停止水培。所用营养液为霍格兰和阿农通用营养液(Hoagl and Amon),配方为:硝酸钙(945 mg/L)、硫酸钾(607 mg/L)、磷酸二氢铵(115 mg/L)、硫酸镁(493 mg/L)。收集到的营养液经装有20 mL XAD-4树脂的树脂柱进行根系分泌物收集,再用200 mL甲醇洗脱树脂中的根系分泌物,将洗脱液于55 ℃减压蒸发出甲醇后,加入2 mL超纯水溶解干燥后的根系分泌物,于-20 ℃保存,作为待测液,供酚酸类物质检测用,每个处理3次重复。

1.2 酚酸类物质含量的检测

采用高效液相色谱法(赛默飞世尔的HPLC U3000高效液相色谱系统)对根系分泌物中的酚酸类物质含量进行测定,色谱柱为4.6 mm×250 mm C18柱。精密吸取1 mL样品,用超纯水定容至5 mL,经0.22 μm微孔滤膜过滤进样,进样量为20 μL。其中,柠檬酸单标:流动相为甲醇∶水(含0.5%H3PO4)=2∶98,柱温30 ℃,流速0.6 mL/min,检测波长220 nm。对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸混标:流动相为甲醇∶水(含0.5%H3PO4)=15∶85,柱温30 ℃,流速1 mL/min,检测波长254 nm。香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水杨酸、苯丙酸、肉桂酸混标:流动相为甲醇∶水(含0.5%H3PO4)=35∶65,柱温30 ℃,流速1 mL/min,检测波长254 nm。对样品采用标准品色谱保留时间进行定性,以峰面积进行定量计算分析。

1.3 酚酸类物质自毒作用的生物检测

选取均匀一致的芝麻种子,放于铺有两层滤纸的培养皿中,每皿60粒,每个处理3次重复。根据3个芝麻品种花期根系分泌物中检测到的酚酸的种类和含量,设置12种酚酸类化感物质的自毒作用检测(以无菌水为对照),每种酚酸3个浓度梯度,处理详见表1,每个处理3次重复。向培养皿中分别加入不同浓度的测定液5 mL,于25 ℃恒温培养箱中暗培养7 d,期间于培养第3天再次相应加入以上测定液各5 mL,其他时间适当补充蒸馏水,保持滤纸湿润。测定种子发芽率、胚芽和胚根的长度以及芝麻幼苗鲜重,并计算化感作用效应指数(RI)。

表1 酚酸类物质及其相应浓度梯度

1.4 数据分析与统计

化感作用效应指数(response index, RI)的计算方法参照Williamson[22]:RI=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1 (T0时,表示促进作用;当RI<0时,表示抑制作用;RI的绝对值大小代表化感作用强度。综合化感指数(synthetical effect, SE)为测试指标的RI平均值。

采用SPSS statistics 20软件利用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行同一品种不同处理间酚酸类物质含量及其自毒作用生物检测结果的差异显著性检验(LSD法)和新复极差分析(Duncan法),显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 连作对芝麻根系分泌物中酚酸类物质含量的影响

由表2看出,在正茬条件下,赣芝9号根系分泌物中含量较高的酚酸类物质依次是水杨酸、苯丙酸、柠檬酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸和香豆酸;金黄麻根系分泌物中含量较高的酚酸依次是水杨酸、柠檬酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸;玉山黑芝麻根系分泌物中含量较高的酚酸依次是水杨酸、对羟基苯甲酸、柠檬酸和香豆酸。由此可见,3个芝麻品种根系分泌物中含量均较高的酚酸为水杨酸、柠檬酸和对羟基苯甲酸。

连作导致芝麻根系分泌物中酚酸种类和含量有所变化,具体表现为:连作条件下赣芝9号根系分泌物中新检测到香草酸;连作导致赣芝9号根系分泌物中丁香酸、苯甲酸、香豆酸和柠檬酸含量显著升高,依次升高694.83%、347.58%、289.04%、178.80%;而咖啡酸、对羟基苯甲酸、绿原酸和水杨酸含量显著降低,依次降低90.23%、73.90%、57.99%、35.68%;其他酚酸含量变化不明显。在连作条件下金黄麻和玉山黑芝麻根系分泌物中均新检测到丁香酸和苯丙酸,且苯丙酸含量急剧升高。连作导致金黄麻根系分泌物中香豆酸、苯甲酸、柠檬酸、香草酸、绿原酸、对羟基苯甲酸和水杨酸含量显著升高,依次升高694.92%、314.08%、270.26%、130.00%、111.49%、47.05%和35.30%;连作对其他酚酸含量无显著影响。连作导致玉山黑芝麻根系分泌物中绿原酸、水杨酸、苯甲酸和阿魏酸含量显著升高,依次升高201.16%、168.76%、98.53%和39.50%;柠檬酸和肉桂酸含量分别降低46.92%、62.92%,对其他酚酸含量影响较小。

综合分析酚酸类物质在3个芝麻品种根系分泌物中的含量及其在正茬和连作处理间的变化,初步认为柠檬酸、苯甲酸、香豆酸和丁香酸可能是导致赣芝9号连作障碍的化感物质;苯丙酸、苯甲酸、柠檬酸、水杨酸、香豆酸、丁香酸和对羟基苯甲酸可能是导致金黄麻连作障碍的化感物质;水杨酸、苯丙酸、丁香酸和苯甲酸可能是导致玉山黑芝麻连作障碍的化感物质。

表2 连作对芝麻根系分泌物中酚酸类物质含量的影响μg/g

注：N表示未检测到；表中同一品种同一列数据后不同小写字母表示在0.05水平上的差异显著性。

2.2 酚酸类物质自毒作用的生物检测

根据3个芝麻品种根系分泌物中检测到的酚酸的种类和含量,设置12种酚酸类物质的自毒作用生物检测(表1)。结合2.1得出的初步结果,本文仅展现可能导致各个芝麻品种连作障碍的化感物质的相关结果(表3～表5)。

2.2.1 赣芝9号的生物检测 整体而言,与CK相比,表3中4种酚酸类物质对赣芝9号发芽率无显著影响,对鲜重和芽长有显著影响(P<0.05),对根长影响达到极显著水平(P<0.01)。与CK相比,苯甲酸在低浓度时(B1)仅对鲜重有促进作用,对发芽率、芽长和根长无显著影响；在中浓度时(B2)对4个发芽指标均无显著影响；高浓度苯甲酸(B3)导致赣芝9号芽长和根长显著降低,对鲜重和发芽率影响不显著。香豆酸在低浓度时(Co1)对发芽率、芽长和根长无显著影响,但对鲜重有促进作用；在中浓度时(Co2)显著降低根长,但对发芽率、鲜重和芽长无显著影响；在高浓度时(Co3)可显著降低赣芝9号的鲜重、芽长和根长。柠檬酸在低浓度时(Ci1)对发芽指标无显著影响；在中浓度时(Ci2)会显著降低鲜重和根长,但对发芽率和芽长影响不显著；在高浓度时(Ci3)导致鲜重、芽长和根长均显著降低。丁香酸仅在高浓度(Sy3)时显著降低赣芝9号的发芽率、鲜重和芽长,但对根长影响不显著。结合以上3种酚酸类物质在赣芝9号根系分泌物中检测到的浓度(表2),苯甲酸仅在高浓度(B3)时对赣芝9号的发芽指标有影响,而此浓度显著高于检测到的浓度,认为苯甲酸不是直接导致赣芝9号连作障碍的化感物质;香豆酸和柠檬酸在中浓度时已经对赣芝9号的发芽有显著抑制作用,丁香酸在高浓度时也显著抑制赣芝9号的发芽,且3个物质的浓度均接近赣芝9号在连作条件下根系分泌物中的浓度,因此认为香豆酸、柠檬酸和丁香酸是导致赣芝9号连作障碍的化感物质。

表3 酚酸类物质对赣芝9号种子发芽的影响

注：B、Co、Ci和Sy分别代表苯甲酸、香豆酸、柠檬酸和丁香酸;后缀1、2、3分别表示酚酸的3个浓度梯度。表中同一列数据后不同小写字母表示差异显著性达到了0.05水平，下同。

2.2.2 金黄麻的生物检测 由表4可以看出,与CK相比,苯甲酸在低浓度时(P1)显著降低金黄麻的发芽率,对其他指标无影响；在中浓度(P2)和高浓度(P3)时显著抑制金黄麻的发芽率、鲜重和芽长,但对根长无显著影响。柠檬酸在低浓度(Ci1)和中浓度(Ci2)时对发芽指标无影响,在高浓度时(Ci3)可显著抑制金黄麻苗的鲜重、芽长和根长。水杨酸在低浓度时(Sa1)导致金黄麻的芽长和鲜重降低,对发芽率和根长无显著影响；在中浓度时(Sa2)导致发芽率、鲜重和根长降低,对芽长无显著影响；在高浓度时(Sa3)可显著抑制4个发芽指标。香豆酸在低浓度时(Co1)对金黄麻的发芽指标无影响；在中浓度(Co2)时显著降低金黄麻苗的鲜重和根长；在高浓度时(Co3)对4个发芽指标均有显著抑制作用。丁香酸在低浓度时(Sy1)对金黄麻的发芽指标无影响；在中浓度(Sy2)时可显著降低鲜重、芽长和根长；在高浓度则对4个发芽指标均有显著抑制作用。对羟基苯甲酸在低浓度(H1)和中浓度(H2)时对金黄麻发芽指标无影响,但高浓度(H3)可显著抑制其4个发芽指标。结合上述酚酸物质在金黄麻根系分泌物中检测到的浓度(表2),柠檬酸和对羟基苯甲酸仅在高浓度时对金黄麻的发芽产生抑制作用,香豆酸虽然在中浓度时就已经对金黄麻的发芽有抑制作用,但这3种酚酸此时的浓度均超出了其在根系分泌物中检测到的浓度,故认为柠檬酸、对羟基苯甲酸和香豆酸不是直接导致金黄麻连作障碍的化感物质;而苯丙酸、苯甲酸、水杨酸和丁香酸在检测到的浓度范围内(低浓度或中浓度时)均对金黄麻的一个或几个发芽指标产生抑制作用,因此认为苯丙酸、苯甲酸、水杨酸和丁香酸是导致金黄麻连作障碍的化感物质。

表4 酚酸类物质对金黄麻种子发芽的影响

注：P、B、Ci、Sa、Co、Sy和H分别代表苯丙酸、苯甲酸、柠檬酸、水杨酸、香豆酸、丁香酸和对羟基苯甲酸;后缀1、2、3分别表示酚酸的3个浓度梯度。

2.2.3 玉山黑芝麻的生物检测 与CK相比,水杨酸和苯丙酸的3个浓度梯度均显著降低了玉山黑芝麻苗的鲜重,但对其他指标无影响。丁香酸在低浓度时(Sy1)对玉山黑芝麻的发芽指标无显著影响；中浓度(Sy2)和高浓度(Sy3)均导致鲜重、芽长和根长显著降低,但对发芽率无影响。苯甲酸在低浓度时(B1)对芽长和根长有促进作用；在高浓度时(B3)显著抑制鲜重和芽长；但在中浓度时(B2)对发芽指标无显著影响(表5)。结合这4种酚酸物质在玉山黑芝麻根系分泌物中检测到的浓度(表2),苯甲酸在低浓度和中浓度时对玉山黑芝麻的发芽无抑制作用,认为其不是直接导致玉山黑芝麻连作障碍的化感物质;而水杨酸、苯丙酸和丁香酸在检测浓度范围内均对玉山黑芝麻发芽的1个或几个指标有显著抑制作用,因此认为这3种物质是导致玉山黑芝麻连作障碍的化感物质。

表5 酚酸类物质对玉山黑芝麻种子发芽的影响

注：Sa、P、Sy和B分别代表水杨酸、苯丙酸、丁香酸和苯甲酸;后缀1、2、3分别表示酚酸的3个浓度梯度。

3 结论与讨论

植物根系一个最为显著的特点是不断地向根际土壤中分泌各种不同种类的代谢产物,即根系分泌物。根系分泌物主要包括低分子量的有机化合物(糖类、氨基酸类、酚酸类及其他次级代谢产物)、高分子量黏胶质以及细胞脱落物和裂解物[23]。其中,酚酸类物质被公认为根系分泌物中最主要的化感物质,可对连作作物产生不利影响[11-13]。本文首次分析了12种酚酸在芝麻花期根系分泌物中的含量,发现在正茬条件下,水杨酸、柠檬酸和对羟基苯甲酸在3个黑芝麻品种的根系分泌物中含量均较高；除上述3种酚酸类物质外,赣芝9号、金黄麻和玉山黑芝麻根系分泌物中含量较高的其他酚酸类物质分别是苯丙酸、苯甲酸和香豆酸。结果表明芝麻品种不同,其根系分泌物的组分和含量不同,这与前人在其他作物上的研究结论[20,24]一致。

连作会导致土壤理化环境和生物学环境发生变化:土壤酸化、养分失衡、微生物区系失衡、土壤由细菌型向真菌型转变[2-5],而土壤环境的变化反过来会影响植物的生长发育,从而可能进一步改变植物根系分泌物的组分和含量。本文通过分析3个不同连作抗性芝麻品种在正茬和连作条件下根系分泌物中酚酸类物质组成的变化,发现在连作条件下,赣芝9号根系分泌物中新检测出香草酸;金黄麻和玉山黑芝麻根系分泌物中均新检测到丁香酸和苯丙酸。这与刘苹等[20]对花生的研究结论不同，他们发现连作抗性较强的花生品种的根系分泌物成分变化不大,含量变化较大;连作抗性较差花生品种根系分泌物的组分和含量均有变化。在本研究中,不同连作抗性的3个芝麻品种的根系分泌物组分均发生了变化,且耐连作品种金黄麻和中等耐连作品种玉山黑芝麻表现一致,在连作条件下新检测出2种酚酸物质,而不耐连作品种赣芝9号仅新检测出1种酚酸。此外,其他酚酸类物质在3个芝麻品种根系分泌物中的含量变化也显著不同:赣芝9号根系分泌物中有4种酚酸类物质含量升高,4种物质含量下降;玉山黑芝麻根系分泌物中有4种酚酸类物质含量升高,2种下降;而金黄麻则表现为7种酚酸类物质含量上升,其余无显著变化。由此可见,芝麻根系分泌物中酚酸类物质组分和含量的变化与连作抗性没有明显关系。造成结果差异的原因,一方面与作物不同有关,另一方面与根系分泌物组分的检测有关:本文仅对12种常见的酚酸类物质进行了检测,而刘苹等的检测成分虽然不多,但未局限于酚酸。导致作物连作障碍的因素很多,作物的连作抗性是一个复杂的问题,因此不同芝麻品种对连作障碍的抗性差异仍需从其他方面进行深入研究。

对化感物质进行自毒作用的生物检验是判断该化感物质是否具有生物毒性的主要方法,而通过计算化感物质在作物苗期对部分生理指标的化感效应指数是目前分析的常规方法[19,22,28]。本文根据各个酚酸类物质在3个不同芝麻品种的根系分泌物中所检测出的浓度,进行了不同浓度酚酸对芝麻种子发芽影响的试验,发现绝大多数酚酸对芝麻发芽表现出“低促高抑”现象,结合它们在正茬和连作条件下芝麻根系分泌物中的含量变化,本研究最终认为香豆酸、柠檬酸和丁香酸是导致赣芝9号连作障碍的化感物质,苯丙酸、苯甲酸、水杨酸和丁香酸是导致金黄麻连作障碍的化感物质,水杨酸、苯丙酸和丁香酸是导致玉山黑芝麻连作障碍的化感物质。但是,目前对于根系分泌物的化感作用是否是造成作物连作障碍的主要原因仍存争议:有人认为别人研究中所用的根系分泌物的浓度过高[5],且分泌到土壤中的根系分泌物可被快速降解[5,25],难以累积到其能发挥化感作用的阈值[26,27],因此化感作用不太可能是导致作物连作障碍的主要原因。本文虽然没有检测上述酚酸类物质在连作土壤中的累积含量,但是前人已经证实随着连作年限的延长,土壤中酚酸类物质含量呈上升趋势[20,28],且本文是在根系分泌物可检测到的浓度范围内对芝麻种子发芽有抑制作用的酚酸才具有生物毒性这一前提下,推断出哪些酚酸是导致芝麻连作障碍的化感物质。因此,本文关于不同连作抗性芝麻化感物质的结论是可靠的,可以为芝麻连作障碍机理提供理论支撑。不过,本文仅对12种酚酸类物质进行了初步研究,根系分泌物中的其他物质是否也对芝麻产生自毒作用,仍有待进一步研究。

本文通过分析不同连作抗性芝麻根系分泌物中酚酸类物质含量在正茬和连作处理间的变化及其自毒作用,初步得出了3个芝麻品种根系分泌物中存在的化感物质,为芝麻连作障碍机理研究提供了一定的科学依据。但是,根系分泌物除了通过化感作用抑制植物生长直接导致连作障碍外,还可通过改变植物根际和根区土壤的理化性质、微生物组成及土壤酶活性等间接影响植物的生长[25,29-30],土壤环境的变化反过来会进一步影响植物根系分泌物的分泌,如此恶性循环加剧作物连作障碍的发生。因此,芝麻根系分泌物中其他物质(包括本文中没有化感作用的其他酚酸物质)与土壤环境间如何相互影响,其与不同芝麻品种间的连作抗性又有何关系亦需深入研究。