张英杰 张 卫 徐鸣曙 张杏林 张 荻 程爱芳

（1.上海市针灸经络研究所，上海200030；2.厦门市中医院，福建厦门361009；3.上海中医药大学，上海201203）

卒中后抑郁（PSD）是脑卒中后常见的一种并发症，发病率和漏诊率较高，极易导致“因病致郁”“因郁致病”的恶性循环，增加了脑卒中患者的致残率和死亡率[1]。PSD发病原因较为复杂，目前尚不明确。海马与情感、认知功能密切相关。PSD患者普遍存在海马神经细胞受损、凋亡以及神经再生障碍[2]。脑源性神经营养因子（BDNF）广泛存在于海马、大脑皮层、小脑等部位，能够营养支持多种神经元，减少神经细胞凋亡，提高神经元的生存率，促进神经再生。近年来，不断有研究者发现PSD患者和模型动物存在BDNF表达减少，而针刺治疗能够逆转这一现象，促进BDNF表达，从而改善患者的抑郁症状[3-4]。本研究通过观察电针干预后PSD模型大鼠海马BDNF、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）、磷酸化核糖体S6蛋白激酶（p-RSK）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白（p-CREB）表达水平的变化，探讨电针通过BDNF/ERK/CREB信号通路调控PSD大鼠海马BDNF表达的机制，揭示针刺干预PSD的作用特点，为临床有效防治PSD提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 成年健康雄性清洁级SD大鼠80只，体重（250±20）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，批号：SYXK（沪）2013-0109。饲养条件：温度（24±2）℃，湿度40%～70%，昼夜交替规律12 h/12 h，正常饮食。实验方法通过上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院伦理委员会审查，符合国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》要求。

1.2 药品与试剂 盐酸氟西汀胶囊（Patheon france）；0.9%氯化钠注射液（浙江济民制药股份有限公司）；p44/42 MAPK（Cell Signaling Technology）；Rabbit mAb（Cell Signaling Technology）；CREB（48H2） Rabbit mAb（Cell Signaling Technology）；Anti-BDNF antibody（3B2，英国Abcam）；RNA酶抑制剂（Invitrogen）；随机引物（Invitrogen）。

1.3 主要仪器 G6805-2A电针仪（上海华谊医用仪器有限公司）；黑色无盖木制敞箱（香港友诚生物科技有限公司）；POWER PAC 3000伯乐电泳仪（BIO RAD）；GIS-1600凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；Veriti DX梯度PCR仪（Life Roche）；480Ⅱ Real Time荧光定量PCR仪（Life Roche）。

2 实验方法

2.1 分组与造模 大鼠适应性喂养7 d后，进行旷场试验，将评分相近的大鼠随机分为正常组、模型组、西药组和电针组，每组20只。正常组大鼠孤养处理，其余各组大鼠采用本课题组前期报道的线栓法大脑中动脉阻塞（MCAO）术[5]联合慢性温和不可预知应激[6]进行造模。MCAO术：大鼠禁食12 h，7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定、备皮，在大鼠颈部做正中切口，钝性分离出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎大鼠颈外动脉远心端，在颈外动脉距离颈总动脉2～3 mm处用4号缝合线打一虚结，夹闭颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉结扎处和虚结之间剪一小口，插入栓线，系紧虚结，松开动脉夹，无出血后剪断颈外动脉，将栓线推入颈内动脉约18 mm，缝合、消毒，90 min后进行再灌注。慢性温和不可预知应激：术后第2日开始相继给予大鼠24 h禁水、24 h禁食、1 min夹尾、5 min 45 ℃烘箱热刺激、5 min 4 ℃冰水游泳、5 min束缚、24 h昼夜颠倒应激，每日随机采用1种方法应激大鼠，同一种方法在同一个周期（7 d）内不重复出现，连续应激21 d。

2.2 干预方法 造模结束第2日给予各组大鼠相应处理。模型组予2 mL生理盐水灌胃；西药组予2 mL盐酸氟西汀溶液0.2 mg/kg灌胃[7]；电针组予30 min电针治疗，取穴：百会、丰隆、太冲、三阴交，百会斜刺进针，余穴直刺[8]，丰隆、太冲接电针仪，频率2 Hz，电流强度以大鼠耐受为宜。以上干预方法均1次/d，连续治疗21 d。

2.3 观察指标

2.3.1 神经功能缺损评分 采用MENZIES等[9]的改进评分法在MCAO术前1 h、术后24 h、应激21 d和治疗21 d时对大鼠进行神经功能缺损评分。大鼠右前肢出现肩或（和）肘内收屈曲，或（和）肩关节内旋，记为1分，无此现象则记为0分；大鼠右前肢阻力减小或（和）行走偏右侧，或（和）向右侧转圈，记为1分，无此现象则记为0分；大鼠右前肢肌张力下降记为1分，无此现象则记为0分；大鼠不停地向右侧旋转记为1分，无此现象则记为0分。满分为4分，MACO术后24 h和应激21 d时大鼠神经缺损评分≥1分视为造模成功。

2.3.2 体重 于MCAO术前1 h、应激21 d、治疗21 d时记录各组大鼠体重。

2.3.3 行为学指标 旷场试验：于MCAO术前1 h、应激21 d、治疗21 d时进行旷场试验。将长宽高分别为100 cm、100 cm、50 cm的黑色无盖木质敞箱底面划分为16 个面积为25 cm×25 cm的小方格，大鼠禁水24 h后放在敞箱底面中心位置，观察3 min内大鼠的活动情况，以大鼠穿越方格数作为水平运动得分，大鼠后肢直立次数作为垂直运动得分，两者相加计算大鼠运动总得分[10]。糖水试验[11]：于MCAO术前1 h、应激21 d、治疗21 d时进行糖水试验。大鼠禁食禁水8 h后，给予已称重的2%蔗糖水和蒸馏水各1瓶，24 h后调换蔗糖水瓶和蒸馏水瓶的位置，48 h后再次对2 瓶称重。大鼠糖水消耗率（%）=蔗糖水饮用量/（蔗糖水饮用量+蒸馏水饮用量）×100%。

2.3.4 海马BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB表达 治疗结束当天，每组随机选取10只大鼠，麻醉后取脑，冰盘上迅速分离出海马，置于冻存管中，-86℃保存。左侧海马用于BDNF、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB蛋白水平检测，采用Western-blot法，每20 mg海马组织加入100 μL裂解液，匀浆机中充分裂解后，离心半径24 cm，12 000 r/min离心5 min，取上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。灌胶，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，配胶，转膜（200 mA，70 min），加入二抗（weiao，1∶2 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜，膜于化学发光检测试剂反应2 min，暗室中用X胶片感光、显影、定影、成像。以β-actin为内参照，使用Image J软件对不同蛋白条带进行定量分析。

2.3.5 海 马BDNF mRNA、CREB mRNA表 达 右侧海马用于BDNF mRNA、CREB mRNA表达的检测。采用RT-PCR法，提取海马总RNA，根据试剂盒操作说明，进行逆转录反应，荧光定量PCR扩增。引物 序 列：5’-GCGGCAGATAAAAAGACTGC-3’，5’-G C A G C C T T C C T T C G T G T A A C-3’，5’-A C C A G C A G A G T G G A G A T G C T-3’，5’-GGGCTAATGTGGCAATCTGT-3’；反 应 条 件：95℃预变性2 min，然后进行45个循环扩增（95℃变性5 s，60℃退火延伸10 s）。以GAPDH为内参照，采用相对含量2-△△Ct分析法计算BDNF mRNA、CREB mRNA相对表达量。

2.4统计学方法 采用SPSS24.0统计软件对相关数据进行统计分析。计量资料用（-x±s）表示，组内比较采用重复测量资料方差分析，组间比较采用随机方差分析，不满足正态分布或方差不齐的数据采用秩和检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠各时期神经功能缺损评分比较 MCAO术后24 h和应激21 d时，模型组、西药组和电针组大鼠神经功能缺损评分比较差异无统计学意义（P＞0.05）。应激21 d时，与正常组和本组MCAO术前1 h相比，其余3组大鼠神经功能缺损评分均明显升高（P＜0.05），提示脑卒中模型制备成功。治疗21 d时，西药组、电针组大鼠神经功能缺损评分组间比较，与同时期正常组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较评分明显降低（P＜0.05）。详见表1。

3.2 各组大鼠各时期体重比较 MCAO术前1 h，各组大鼠体重比较差异无统计学意义（P＞0.05）。应激21 d，模型组、西药组和电针组大鼠体重均明显低于正常组（P＜0.05），提示抑郁模型制备成功。治疗21 d，西药组和电针组大鼠体重组间比较无统计学差异（P＞0.05），但均明显高于模型组（P＜0.05）。详见表2。

3.3 各组大鼠各时期旷场试验得分比较 MCAO术前1 h，各组大鼠旷场试验得分比较差异无统计学意义（P＞0.05）。应激21 d，模型组、西药组和电针组大鼠旷场试验得分均明显低于正常组（P＜0.05），提示抑郁模型制备成功。治疗21 d，模型组大鼠矿场试验得分持续降低（P＜0.05），西药组和电针组大鼠旷场试验得分比较差异无统计学意义（P＞0.05），且均明显高于模型组和 本 组 应 激21 d时（P＜0.05）。详见表3。

3.4 各组大鼠各时期糖水消耗量比较 MCAO术前1 h，各组大鼠糖水消耗量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。应激21 d，模型组、西药组和电针组大鼠糖水消耗量均明显低于正常组（P＜0.05），提示抑郁模型制作成功。治疗21 d，西药组和电针组大鼠糖水消耗量比较无统计学差异（P＞0.05），且均明显高于模型组和本组应激21 d时（P＜0.05）。详见表4。

3.5 各组大鼠干预后海马ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB和BDNF mRNA、CREB mRNA表达比较 与正常组比较，模型组大鼠海马BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB和BDNF mRNA、CREB mRNA表达均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，西药组和电针组大鼠上述指标均明显升高（P＜0.05），且西药组和电针组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表5。

表1 各组大鼠各时期神经功能缺损评分比较（±s） 单位：分

表1 各组大鼠各时期神经功能缺损评分比较（±s） 单位：分

注： 与同时期正常组比较，*P＜0.05；与同时期模型组比较，#P＜0.05；与本组MCAO术前1 h比较，△P＜0.05；与本组术后24 h比较，▲P＜0.05；与本组应激21 d比较，☆P＜0.05。

组别 动物数/只 MCAO术前1 h 术后24 h 应激21 d 治疗21 d正常组 20 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型组 20 0.00±0.00 1.90±0.74*△ 1.60±0.84*△ 1.30±0.68*△▲西药组 20 0.00±0.00 2.10±0.61*△ 1.90±0.62*△ 0.60±0.48#▲☆电针组 20 0.00±0.00 1.98±0.91*△ 1.75±0.87*△ 0.25±0.35#▲☆

表2 各组大鼠各时期体重比较（±s） 单位：g

表2 各组大鼠各时期体重比较（±s） 单位：g

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数/只 MCAO 术前1 h 应激21 d 治疗21 d正常组 20 265.63±16.26 382.42±15.96 470.42±13.27模型组 20 270.80±6.76 357.60±33.40* 410.95±24.73*西药组 20 280.20±21.64 357.75±26.43* 442.15±25.33*#电针组 20 276.00±19.30 354.19±12.66* 445.31±11.48*#

表3 各组大鼠各时期旷场试验得分比较（±s） 单位：分

表3 各组大鼠各时期旷场试验得分比较（±s） 单位：分

注： 与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与本组MCAO术前1 h比较，○P＜0.05；与本组应激21 d比较，☆P＜0.05。

组别 动物数/只 MCAO 术前1 h 应激21 d 治疗21 d正常组 20 40.17±18.81 33.25±14.42 29.50±14.90○模型组 20 37.90±17.18☆ 20.00±13.22* 12.30±10.98*○☆西药组 20 39.40±19.06☆ 16.50±6.57* 27.30±14.62#○☆电针组 20 34.75±22.44☆ 17.88±16.40* 27.88±18.69#○☆

表4 各组大鼠各时期糖水消耗量比较（±s） 单位：%

表4 各组大鼠各时期糖水消耗量比较（±s） 单位：%

注： 与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与MCAO术前1 h比较，○P＜0.05；与本组应激21 d比较，☆P＜0.05。

组别 动物数/只 MCAO术前1 h 应激21 d 治疗21 d正常组 20 88.01±10.01 85.30±9.22 86.43±9.62模型组 20 86.96±6.70☆ 68.37±16.75* 68.53±19.35*○西药组 20 85.41±9.83☆ 66.18±16.81* 80.52±9.56#☆电针组 20 88.58±3.67☆ 69.68±12.50* 85.50±6.08#☆

4 讨论

脑卒中后抑郁可归属于中医学“中风病”与“郁病”合病范畴。中风后患者瘀血阻滞、痰热内蕴，或阳化风动，血随气逆，上犯于脑，导致脑络受损，神明失用，元神失主，精神失养，导致脑卒中后抑郁。现代医学对PSD的发病机制研究较多，认为其与神经递质紊乱、基因多态性、BDNF紊乱、细胞炎性因子、社会心理学等密切相关。

表5 各组大鼠海马BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB 和BDNF mRNA、CREB mRNA 表达比较（±s）

表5 各组大鼠海马BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB 和BDNF mRNA、CREB mRNA 表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数/只 BDNF ERK p-ERK p-RSK CREB p-CREB BDNF mRNA CREB mRNA正常组 10 1.24±0.15 0.94±0.07 1.63 ±0.28 1.09±0.32 1.23±0.44 1.14±0.36 2.293±0.586 1.025±0.067模型组 10 0.36±0.22* 0.49±0.25* 0.80±0.38* 0.36±0.09* 0.38±0.18* 0.31±0.18* 1.385±0.862* 0.875±0.227*西药组 10 1.00±0.31# 0.81±0.14# 1.54±0.55# 0.97±0.28# 1.06±0.48# 1.07±0.35# 2.341±0.577# 1.133±0.083#电针组 10 1.03±0.29# 0.80±0.18# 1.36±0.35# 1.00±0.29# 1.10±0.38# 1.11±0.42# 2.141±0.440# 1.110±0.265#

本研究采用MACO术联合慢性不可预知温和应激制备PSD模型。MACO术后24 h，大鼠出现不同程度的肢体运动功能障碍和神经损伤，在应激21 d时，大鼠肢体运动功能障碍和神经损伤仍然持续存在。此外，造模大鼠还表现出了抑郁症的核心症状：食欲减退，体重较正常组大鼠增长缓慢；快感缺失，对奖赏反应不敏感，糖水消耗量减少；兴趣减退，对开阔环境的焦虑，自发活动减少，旷场试验得分降低。大鼠运动功能障碍和神经损伤的持续存在、体重增长缓慢和行为学的改变提示PSD大鼠模型制备成功。

目前，对PSD的治疗主要以抗抑郁药物为主。盐酸氟西汀是临床常用于治疗PSD的五羟色胺再摄取抑制剂类（SSRIs）类药物，疗效确切，能够抑制5-HT的再吸收，调节BDNF的表达，提高神经元的存活率，改善抑郁症状，且经常被用于抗抑郁疗法的对照研究[12-14]。近年来，针灸治疗PSD因其安全、可靠、副作用小的优势成为关注的热点[15]。本研究选取百会、丰隆、太冲、三阴交穴进行针刺和电针治疗。百会穴具有开窍醒神、祛风通络之功，丰隆穴善于调理脾胃、化痰祛湿，太冲穴长于疏肝理气、调和气血，三阴交可活血化瘀、调肝补肾。四穴共用，以达到行气解郁、化痰祛湿、祛瘀通络、开窍醒神、培补肝肾的功效。丰隆、太冲接电针，可通过低频电流刺激，提高神经肌肉兴奋性，改善大鼠肢体运动障碍，加强穴位的治疗作用。

本研究发现，模型组大鼠海马BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB、BDNF mRNA、CREB mRNA的表达均明显低于正常组。在BDNF/ERK/CREB信号转导通路中，BDNF与其特异性受体TrkB结合后可激活ERK，ERK被激活后可通过磷酸化激活一系列细胞膜表面以及细胞质、细胞核内的核糖体S6蛋白激酶（RSK）的蛋白激酶底物，使之磷酸化后与其共同入核，促进CREB等重要转录因子的磷酸化，从而调节CREB、BDNF基因的转录表达[16]。脑缺血再灌注和慢性不可预知应激损伤，抑制了BDNF/ERK/CREB信号转导通路活性，使该通路中的关键因子BDNF、ERK、RSK、CREB表达减少。ERK、RSK、CREB蛋白的生物活性与其磷酸化水平是相关的，所以模型组大鼠海马p-ERK、p-RSK、p-CREB的表达减少，不能够充分发挥促进CREB、BDNF基因的转录表达的作用，因而海马BDNF mRNA、CREB mRNA的表达也减少，并最终导致了BDNF表达的进一步减少，使其不能充分发挥神经保护作用，海马受损和凋亡的神经细胞得不到修复和再生，最终导致造模大鼠体重增长缓慢，快感缺失，自发活动减少以及运动功能障碍。治疗21 d时，西药组与电针组大鼠海马BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB、BDNF mRNA、CREB mRNA表达显著高于模型组，与正常组无显著性差异，推测电针和盐酸氟西汀干预可通过上调BDNF/ERK/CREB信号转导通路中的关键因子BDNF、ERK、RSK、CREB的表达，并促使其磷酸化，进而促进CREB、BDNF基因的转录表达，进一步增加BDNF表达。BDNF表达增多，可发挥神经保护作用，改善大鼠肢体运动功能障碍，缓解大鼠的抑郁症状。西药组与电针组大鼠各项指标无明显差异，可能与盐酸氟西汀和电针的抗抑郁作用均是多层次、多水平、多靶点有关。今后还需要进一步探讨BDNF及BDNF/ERK/CREB信号转导通路与PSD行为学改变及海马神经元损伤的关系，以深入阐明电针治疗PSD的作用机制。