（广州市刑事科学技术研究所，广东广州 510030）

引言

水中尸体的死因判断常常是法医工作中的难题，法医工作者常采用硅藻形态学检验的方法来判断其死因。传统的硅藻形态学检验方法有强酸消化法、微波消解法、酶消化法等。其中微波消解-滤膜富集-扫描电镜联用法［1］凭借其高硅藻回收率、定性定量分析准确的优点，在疑难案件分析中得到了广泛应用，但成本较高、操作复杂的特点，限制了其在公安基层单位的普及。同时，由于形态学方法对专业知识有较高的要求，常出现假阳性或假阴性的结果，造成不良影响。随着分子生物学技术的不断发展，浮游生物多样性的研究有了新的进展。如今，以水中浮游生物的DNA标记为检测对象，把高通量测序技术应用到浮游生物多样性研究中，建立了浮游生物多样性的高效检测技术，这种方法简单、快捷、通量高且成本低。本文就浮游生物中藻类及细菌的高通量测序及分子生物学检测的研究作一综述。

1 藻类的研究

1.1 高通量测序法检测藻类研究

硅藻属于真核生物，科属种类繁多，具有环境选择性。EGI和EG2，SK1和SK2属于硅藻叶绿素相关基因，人体组织中不存在，可用来建立浮游生物检测方法以诊断溺死。Sumiko 发现编码EG1 和EG2 相关基因可以得到五种海水硅藻属的PCR 产物，而SK1 和SK2 基因只能得到部分中心硅藻纲的PCR 扩增产物。同时，该方法可以检测到5mL 血液中的所含藻类。该实验表明利用EG相关基因作为标记分子所建立的PCR 检测方法，可以鉴别较多种类淡水的硅藻，适用于淡水溺死案件的诊断。

在浮游生物多样性研究中，DNA 的可变区，如18S rDNA 的8 个可变区［V1-V9（不含V6）］，是标记其生物多样性的关键区域，也是能反映生物生长环境的重要标记基因。Zhao利用焦磷酸（PSQ）对硅藻18S rDNA的V7区域进行测序，发现硅藻种群分布与其生长环境关系密切，从而为构建一种通过研究浮游生物多样性来推断溺死地点提供了可能。

上述研究表明，基于18S rDNA 的V4 区、ITS、rbcl、COI等扩增子测序技术，所建立的海水及淡水微型真核浮游生物检测方法均具有较高的灵敏性及特异性，提示检测溺死相关浮游生物DNA的高通量测序方法具有区分不同浮游生物的能力，从而为溺死地点的推断提供有力支持。

1.2 其他分子生物学方法检测藻类的研究

袁健使用荧光定量PCR技术（qPCR）研究东海的浮游植物，建立了三种重要赤潮藻的qPCR检测方法，可现场对东海赤潮藻进行物种分析及数量推断。此法灵敏性和特异性较高，耗时较短，但较高的成本、引物与探针的特异性则限制了其大规模的应用。Nübel采用变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）检测浮游生物16S rRNA片段以进行种群鉴定和群落分析，其扩增产物多态性信息丰度较高，适用于浮游生物种群分析。该法相较于传统的形态学方法具有快速、准确的特点，然而复杂的实验流程、较高的成本和较低的覆盖度则限制了此技术的进一步发展。

2 细菌的研究

2.1 16S rDNA扩增子测序分析浮游细菌的研究

气单胞菌、发光杆菌、弧菌属原核生物，在自然界中分布广泛。同硅藻一样，水生细菌的基因特性与其生长环境也具有一定的相关性。

阴星望、刘强基于细菌16S rDNA高通量测序技术，探讨了湖泊、海洋浮游细菌及细菌群落结构及丰度变化，发现高通量测序分析可以更精确地揭示水生菌群的群落结构信息。饶静静选取气溶素基因（hlyA）、溶血素基因（aerA）以及该菌属所特有的内参照基因16S rDNA保守区建立了嗜水气单胞菌多重PCR检测方法；针对唾液链球菌（SL1）和血链球菌（SN1）和嗜水气单胞菌（AH1），Suto设计不同的引物对，建立的新型PCR方法在细菌DNA的检测方面具有较高的特异性和灵敏性，适用于含有浮游生物较少的水中发现的尸体（如自来水）。麦柏盛在研究嗜水气单胞菌（gyrB）和16Sr RNA 基因毛细管电泳检测方法时，使用了Miwako 和饶静静分别报道的引物AH和Ah两组基因，验证了两组的引物均有良好的特异性，适用于细菌的分类标记，且将此方法应用于实际案例，为溺死诊断的研究提供了新方法。

2.2 其他分子生物学方法分析浮游细菌的研究

Uchiyama 采用TaqMan PCR 检测三个海洋浮游生物细菌属（气单胞菌、弧菌、发光杆菌），此PCR 分子标记法比常规的PCR 法多增加了一对荧光引物，在扩增时，总荧光强度会随着扩增产物的不断增加而逐渐增强，呈现一种指数关系，提高了分子标记的准确性。且对其进行交叉反应时，也表现出明显的特异性。但较高的成本则限制了其大规模应用。因此当实验规模不大时，利用TaqMan PCR法检测水生细菌也是可行的。

3 小结

对比上述检测方法，对于藻类和浮游细菌基因组的种类、分布及数量检测，高通量测序技术将每个序列与参考条形码库进行比较，在每次测序过程中获得大量数据。由此可见，利用高通量测序技术进行溺死相关浮游生物检测，具有降低成本，提高检测效率等优点。

4 结语

综上，引物的设计和目的基因的选择无疑是高通量测序过程中的关键点，文献研究发现，在研究浮游生物多样性时，硅藻的测序多选用18S rDNA 的V4、V9 区作为目的基因设计引物，Stoeck 发现V4 区在亲缘关系较近的物种区分方面具有优势，V9区更适合挖掘生物总体信息，发现更多种类的物种；发光杆菌、弧菌、气胞单菌等细菌则以16S rDNA扩增子测序为主，具有较高的特异性及稳定性，可快速准确地确定浮游生物种属，获取浮游生物种群分布、群落结构及丰度差异等大量信息。

高通量测序技术结合了分子生物学、生物信息学和统计学等多门学科，可构建一种全面的溺死相关浮游生物多样性分析方法，以期达到对浮游生物快速、准确和全面检测的目的。尽管现在高通量测序技术存在着高成本的劣势，但相信在不久的将来，凭借其准确性高、耗时较短、安全性高等优点，高通量测序技术定会拓宽浮游生物多样性研究的方向，为溺死诊断提供新的方法。