黄志锋 罗文婷 廖陈喜 陈 浩 胡海圣 孙宝清

(广州呼吸健康研究院，呼吸疾病国家重点实验室，国家呼吸临床研究中心，广州医科大学附属第一医院变态反应科，广州医科大学，广州 510120)

Ⅰ型过敏性疾病是一类由IgE介导的全身性疾病，涉及多器官和多系统[1]。过敏性鼻炎和哮喘是最常见的气道过敏性疾病，因它们属于同一个气道，具有一些共同的临床特征被称为联合呼吸道疾病(United Airways Diseases,UADs)[2,3]。世界卫生组织报告称，全世界约有3亿和4亿患者分别患有哮喘和过敏性鼻炎[4,5]，并且这一患病人数还在不断增长，尤其是在发达国家[6]。而病因诊断的局限性导致过敏性鼻炎和哮喘患者的症状反复发作，严重影响生活质量，因此明确气道过敏原在UADs诊治防治中起着非常重要的作用。目前已经确定免疫球蛋白E(Immunoglobulin E,IgE)在Ⅰ型过敏疾患中显著升高[7,8]。过敏原的筛查可以通过血清特异性IgE(specific IgE,sIgE)的浓度或使用高纯度过敏原提取物进行皮肤点刺试验(Skin Prick Test,SPT)来确定，而体外血清sIgE测试不受患者皮肤、服药等因素的干扰，有效避免了个体差异带来的结果不确定性及不良反应的发生，已成为过敏原检测的最主要工具[7]。

长期以来，临床应用的sIgE定量检测系统较少，以Thermo Fisher的ImmunoCAP系统较为常见，该系统采用荧光酶联免疫法，是目前国际认可的过敏原sIgE检测方法[10]；但该系统花费成本较高，在国内很难大范围推广。微阵列化学发光免疫分析系统(BioIC chemiluminescence immunoassay,BioIC)因其血清样品需求量少，检测成本低，可同时检测多种过敏原sIgE的特点而具有良好的临床应用前景[11]；高通量检测过敏原的sIgE可以提供与临床诊断相关的过敏原信息，并可以帮助患者预知某些还没有出现临床症状低水平sIgE阳性过敏原的风险。本研究首次采用微流控技术搭载化学发光应用于检测过敏原sIgE，检测19项过敏原sIgE，结合本地区过敏原分布特点分析过敏原谱及共致敏现象，为临床诊断提供相关信息。

1 材料与方法

1.1实验材料 2016年1月～2018年12月就诊于广州医科大学附属第一医院，确诊为过敏性鼻炎和(或)哮喘患者，并经ImmunoCAP 1000系统检测血清sIgE为多重过敏原阳性(包括尘螨，蟑螂、动物毛发和虾蟹等常见过敏原)的患者血清245例。其中男143例、女102例，年龄分布为23(8,23)(中值，25%，75%)，年龄<18岁110例，≥18岁为135例。包括过敏性鼻炎患者92例，过敏性哮喘患者117例，过敏性鼻炎合并哮喘患者36例，三组患者的总IgE水平分布分别为322(198,741)，552(218,917)，781(301,1230)(见表1)。本研究及患者血清的使用经广州医科大学附属第一医院伦理委员会批准：GYYY-2016-73。

表1 根据不同疾病类型描述患者基本信息Tab.1 Patient demographic characteristics based on different diseases

1.2实验方法 本研究采用BioIC检测系统以利用类似ELISA微量孔盘内进行的间接酶联免疫冷光分析技术对血清过敏原sIgE进行检测，使用BioIC系统检测19种sIgE过敏原仅需100 μl血清。所有患者均使用含分离凝胶的真空采血管抽取静脉血5 ml，3 000 r/min离心10 min，取上层血清后检测，剩余血清标本收集置于-80℃冰箱长期存储，避免反复冻融。进行检测前，将待检血清提前取出于室温放置约30 min，并使用震荡仪混匀。

使用BioIC化学发光分析仪和过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒(洹艺科技，中国台湾)测量血清过敏原sIgE，包括屋尘螨(d1)、粉尘螨(d2)、热带无爪螨(d201)、猫毛(e1)、狗毛(e5)、狗牙根草(g2)、梯牧草(g6)、蟑螂(i6)、烟曲霉菌(m3)、白色念珠菌(m5)、矮豚草(w1)、鸡蛋(f1)、牛奶(f2)、小麦(f4)、大豆(f13)、花生(f14)、杏仁(f20)、蟹(f23)、虾(f24)。

1.3统计学处理 对于未稀释的血清样品，检测范围为0.21～100 U/ml。使用0.35 U/ml作为阴阳性阈值，sIgE结果≥ 0.35 U/ml则为阳性。按RAST(Radioallegrosorbent test，RAST)分级标准将sIgE阳性结果分为1～6级：级别1(0.35～0.70 U/ml)，级别2(0.70～3.50 U/ml)，级别3(3.50～17.50 U/ml)，级别4(17.50～50.00 U/ml)，级别5(50.00～100.00 U/ml)，级别6(≥100.00 U/ml)。

使用Excel 2016(Microsoft®Excel®2016)和SPSS 23.0(IBM Corp.,Armonk,NY)进行数据分析。采用柱状图表示各项过敏原的阳性率分布，组间阳性率差异采用卡方检验(理论频数出现<5则用fish确切概率法校准)，并采用Bonferroni法校正显著性水平的事后两两比较；以折线图表示不同疾病人群合并致敏分布；对全部过敏原进行标准化后系统聚类分析[12]，并以合适的界限将过敏原分为若干类；使用Kendall`s Tau方法分析各项过敏原相关性。统计时，< 0.21 U/ml，> 100 U/ml分别采用0，101进行统计。P< 0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.119项过敏原sIgE致敏率分布情况 本研究招募的245例多过敏原致敏过敏性鼻炎/哮喘患者人群中，以尘螨(包括屋尘螨、粉尘螨、热带无爪螨)和蟑螂为主要的吸入性过敏原，而虾蟹和牛奶作为主要的食物过敏原。粉尘螨(86.94%)的阳性率最高，其次为屋尘螨(84.49%)；吸入性过敏原中曲霉菌(1.63%)的阳性率最低。食物过敏原中蟹(21.63%)阳性率最高，鸡蛋白(2.04%)的阳性率最低(见图1)。吸入性过敏原(91.02%)总体阳性率显著比食物过敏原(35.92%)总体阳性率高，差异具有统计学意义(χ2=160.417,P<0.01)。

2.2不同疾病患者人群致敏差异分析 按不同疾病类型将研究患者分为鼻炎组、哮喘组和鼻炎合并哮喘组，观察三组患者的各项过敏原致敏差异，并建立合并致敏项数折线图。结果显示(见图2)，三种疾病组的主要致敏过敏原均为三种螨虫和蟑螂，鼻炎合并哮喘组患者的猫毛、狗毛、蟑螂、虾蟹过敏原阳性率高于其他两组疾病患者。卡方检验结果显示，鼻炎组、哮喘组、鼻炎合并哮喘组的狗毛阳性率分别为14.13%，23.08%，38.89%，差异具有统计学意义(χ2=9.371,P=0.009)；两两比较发现，鼻炎合并哮喘组和鼻炎组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。鼻炎组、哮喘组、鼻炎合并哮喘组的蟑螂阳性率分别为26.09%、30.77%、52.78%，差异具有统计学意义(χ2=8.66,P=0.013)；两两比较发现，鼻炎合并哮喘组与鼻炎组、哮喘组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。鼻炎组、哮喘组、鼻炎合并哮喘组的大豆阳性率分别为1.09%、6.84%、11.11%，差异具有统计学意义(χ2=6.713、P=0.026)；两两比较用Bonferroni法调整α水平后结果显示，三种疾病组两两之间差异无统计学意义(P>0.022)。其余过敏原三种疾病组间差异无统计学意义。

图1 呼吸道过敏性疾病患者各项过敏原阳性率分布Fig.1 Positive rate of allergens in patients with respiratory allergic diseasesNote:d1-Der.Pteronyssinus;d2-Der.Farina;d201.Blomia tropicalis;e1.Cat dander;e5.Dog dander;g2.Bermuda grass;g6.Timothy grass;i6.Cockroach;m3.Aspergillus fumigatus;m5.Candida albicans;w1.Ragweed;f1.Egg white;f2.Milk;f4.Wheat;f13.Peanut;f14.Soybean;f20.Almond;f23.Crab;f24.Shrimp.

图2 基于三种疾病人群的各项过敏原阳性率分布Fig.2 Percentages of multiple allergen sensitization to Rhinitis,Asthma,Rhinitis with asthma groups

本研究纳入的呼吸道过敏性疾病患者中有86.12%的患者为多过敏原致敏(合并过敏原阳性项数≥2)；三组疾病患者多过敏原致敏百分比分别为鼻炎88.04%，哮喘84.62%，鼻炎合并哮喘86.11%，三组间差异无统计学意义(P<0.05)。合并致敏项数折线图结果显示(见图3)，鼻炎合并哮喘组患者比单纯鼻炎或单纯哮喘的患者更可能同时对多种过敏原致敏。

图3 基于三种疾病人群的多过敏原致敏百分比分析Fig.3 Number of multiple sensitization to AR,AS,AR&ASNote:*.P<0.05;d1.Der.Pteronyssinus;d2-Der.Farina;d201.Blomia tropicalis;e1.Cat dander;e5.Dog dander;g2.Bermuda grass;g6.Timothy grass;i6.Cockroach;m3.Aspergillus fumigatus;m5.Candida albicans;w1.Ragweed;f1.Egg white;f2.Milk;f4.Wheat;f13.Peanut;f14.Soybean;f20.Almond;f23.Crab;f24.Shrimp.

2.3多重致敏的鼻炎/哮喘患者致敏模式和共同致敏现象探究 基于探索呼吸道疾病各种过敏原的内在联系，对BioIC系统检测的245例患者19项过敏原sIgE进行系统聚类分析，19项过敏可归类为5类不同致敏模式：第一类：屋尘螨/粉尘螨/热带螨/蟹/虾/蟑螂；第二类：狗牙根草/梯牧草/小麦/大豆/花生/矮豚草/杏仁；第三类：猫毛/狗毛/牛奶；第四类：曲霉菌/白色念珠菌；第五类：鸡蛋白(见图4)。结合相关性分析结果：屋尘螨/粉尘螨/热带螨/蟹/虾/蟑螂的相关性在0.857≥ rk.≥0.222,P<0.01，其中三项螨虫之间相关性较好，rk.≥0.553,P<0.01；狗牙根草/梯牧草/小麦/大豆/花生/矮豚草/杏仁的相关性在0.837≥ rk.≥0.232,P<0.01，该类的所有过敏原同源于植物界；猫毛/狗毛/牛奶的相关性在0.432≥ rk.≥0.284,P<0.01；曲霉菌/白色念珠菌相关性为rk.= 0.302,P<0.01。

图4 系统聚类分析谱系图及Kendall`s Tau相关性分析Fig.4 Hierarchical cluster analysis dendrogram and Kendall`s Tau correlation analysisNote:d1.Der.Pteronyssinus;d2.Der.Farina;d201.Blomia tropicalis;e1.Cat dander;e5.Dog dander;g2.Bermuda grass;g6.Timothy grass;i6.Cockroach;m3.Aspergillus fumigatus;m5.Candida albicans;w1.Ragweed;f1.Egg white;f2.Milk;f4.Wheat;f13.Peanut;f14.Soybean;f20.Almond;f23.Crab;f24.Shrimp.

表2 各类致敏模式共致敏现象分析Tab.2 Analysis of co-sensitization phenomena in various sensitization modes

进一步分析各类致敏模式中过敏原共致敏情况(见表2)，四类致敏模式中，类别内任一项过敏原合并其他过敏原阳性的百分率分别为95.35%(205/215),67.44%(29/43),43.53%(37/85)和16.67%(2/12)；而类别内全部过敏原同时阳性的百分率则一般，均<16.67%。

3 讨论

本研究结果显示尘螨(包括屋尘螨、粉尘螨和热带无爪螨)是呼吸道过敏症患者的主要过敏原，其次是蟑螂，猫毛和狗毛过敏原，这与先前研究的结果报道基本一致[13-15]。Li等[16]在一项全国多中心研究报道尘螨是中国最常见的室内气传播过敏原，并且在其入选的所有过敏性疾病患者中对1种或多种尘螨过敏原SPT阳性率达87.2%。本研究中的患者均来自广东省会城市广州(南部沿海地区)，属高温高湿的亚热带季风气候，这种环境适合尘螨的生长繁殖[17]，这也解释了本研究患者中尘螨过敏原的普遍高致敏性，因此对于所有过敏性鼻炎和/或哮喘患者进行尘螨过敏原规避的教育也是非常必要的。此外，蟑螂和猫狗毛过敏原在鼻炎和或哮喘患者中也有较高的阳性率，并以吸入性过敏原(占91.02%)为主要引起呼吸道过敏症，少数食物过敏原(35.92%)也参与这些疾病的发生。

对三组疾病人群阳性率分析，发现鼻炎合并哮喘组患者对于大部分过敏原有较高的阳性水平以及更有可能合并更多项次的过敏原同时致敏。应用酶联免疫捕获法检测广州地区年龄1个月至86岁6419例患者变应原sIgE水平，发现哮喘组、鼻炎组、哮喘合并鼻炎组的屋尘螨、粉尘螨、热带螨、蟑螂的致敏阳性率差异具有统计学意义[14]；本研究哮喘患者屋尘螨、粉尘螨、热带螨的致敏阳性率均低于其他两组患者，但差异无统计学意义，对于大部分常见过敏原，三组患者均具有相似的阳性率，提示过敏性鼻炎和哮喘两者在病因、免疫学和发病机制等方面均非常相似，在过敏原分布上也具有一定的相似性。值得注意的是，过敏性鼻炎合并哮喘患者的猫毛、狗毛和蟑螂过敏原阳性率显著高于其他两组患者，提示这三项过敏原可能会使得呼吸道过敏症病程加重，或是引起多种呼吸道过敏症同时发病。本研究未对患者的疾病严重程度进行评定，因此未能结合病情严重程度进一步分析。对三组疾病的多致敏情况进行分析，过敏性鼻炎，哮喘，过敏性鼻炎合并哮喘患者的多致敏百分比分别为88.04%，84.62%、86.11%，并且鼻炎合并哮喘组患者比单纯鼻炎或单纯哮喘的患者更可能同时对多种过敏原致敏，提示有大部分过敏性鼻炎合并哮喘患者可同时对多种过敏原过敏，因此多过敏原致敏增加疾病的严重性。

多过敏原致敏可能由某些具有高度同源的过敏原之间的共同致敏或交叉反应引起。我们通过系统聚类分析和Kendall`s Tau相关分析将19种常见过敏原分为5类，以观察各项过敏原之间的相似性。其中三种螨虫以及蟑螂和虾蟹被纳为第一类，并且相关性分析结果显示相关系数rK在0.222到0.857之间(P<0.01)；该类中5项过敏原也是本研究中呼吸道过敏症患者的主要吸入性过敏原和主要食物过敏原，并且已经证实虾蟹的主要致敏蛋白原肌球蛋白和螨的Der p10组分蛋白之间存在交叉过敏反应[18,19]。狗牙根草、梯牧草、小麦、大豆、花生、矮豚草、杏仁同属于第二类过敏原，相关性rK在0.232至0.837之间；它们都属于植物来源的花粉或食物过敏原，以往也有研究报道部分花粉过敏并伴发植物来源的食物过敏患者病例，并通过RAST抑制试验提示绝大多数花粉与植物来源的食物过敏原之间具有交叉反应性[20]。猫狗毛和牛奶过敏原作为第三类，其相关性也一般，猫毛和牛奶，狗毛和牛奶的Kendall`s Tau相关系数分别为0.284，0.364。目前国内外较少报道宠物与牛奶过敏原之间的交叉过敏现象，在Mamikoglu等[21]的研究中，对已知宠物过敏的患者建议进一步筛查对肉类和牛奶过敏原。系统聚类分析产生的5类过敏原致敏模式中，类别内全部过敏原同时阳性的百分率较低，而是表现为类别内某一项过敏原合并其他过敏原阳性。

本研究存在一定的局限性，没有收集患者病程病情等信息，无法将患者的患病严重与致敏模式进行联合讨论，对于过敏原存在的交叉过敏探究也只停留在粗提物过敏原层面，在后续的研究中将引入组分诊断解决方案进一步探讨过敏原之间的平行致敏和交叉过敏现象。