刘少宁，李有志，王艳芬，李淑花，王燕，徐恩民

(山东省兽药质量检验所，山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南 250022)

多拉菌素(Doramectin)是新一代大环内酯类抗寄生虫药物，属伊维菌素的衍生物。主要用于治疗胃肠道蛔虫，肺蠕虫，眼丝虫，虱和疥螨等引起的寄生虫病[1-2]。固相萃取技术(solid phase extraction，SPE)是近年发展起来的一种样品预处理技术，其原理是利用组分与吸附剂(固定相)间选择性吸附与选择性洗脱的过程，达到提取分离、净化和富集的目的。当应用于性状为油状的兽药产品检测时，其分离效果较好。多拉菌素注射液性状为无色或微黄色的油状液体，收载在2017版《兽药质量标准》化学品卷，标准【含量测定】中标注的LC-Si固相萃取柱(4.6×150 mm，5 μm)难以购买，且不适合常用固相萃取装置，给检测单位和企业带来麻烦。本研究依据现行的多拉菌素注射液标准，对含量测定中适用的固相萃取柱进行考察试验，完善了多拉菌素注射液含量测定标准[3]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent1260型高效液相色谱仪；Waters Alliance E2695型高效液相色谱仪；色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)；电子天平(型号 BT125D)购自德国赛托里斯公司。

1.2 试药与试剂 多拉菌素对照品(批号为K0461411，标识含量为95.6%)来源于中国兽医药品监察所；多拉菌素注射液(批号：1812002 规格：50 mL：0.5 g)来源于山东鲁抗舍里乐药业有限公司高新区分公司；多拉菌素注射液(批号：1812001 规格：100 mL：1 g)来源于齐鲁动物保健品有限公司；多拉菌素注射液(批号：PS185-1902001规格：50 mL：0.5 g)来源于艾美科健(中国)生物医药有限公司；多拉菌素注射液(批号：D801SICN 规格：50 mL：0.5 g)来源于施维雅(青岛)生物制药有限公司。固相萃取小柱SupelcleanTM LC-Si 6 mL(500 mg)SPE Tubes购自美国Supelco公司；固相萃取小柱Sep-Pak Vac 6cc(500 mg)Silica Cartridges购自美国Waters公司；甲醇为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相：甲醇-乙腈-水(67：15：18)；流速：1.0 mL/min；检测波长245 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取多拉菌素对照品10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇70 mL溶解，加水5 mL，混匀，再加甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取1812002批样品(50 mL∶0.5 g)1 mL至10 mL容量瓶中，加二氯甲烷9 mL稀释制成每1 mL中约含1 mg的溶液，精密量取2.5 mL，过LC-Si固相萃取柱(500 mg/6 mL)，依次用正己烷6.25 mL，二氯甲烷12.5 mL，洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇5 mL洗脱，洗脱液收集于25 mL量瓶中，加水1.25 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2.3 空白溶液的制备 精密量取辅料溶液1 mL至10 mL容量瓶中，加二氯甲烷9 mL定容。精密量取2.5 mL，过LC-Si固相萃取柱(500 mg/6 mL)，依次用正己烷6.25 mL，二氯甲烷12.5 mL，洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇5 mL洗脱，洗脱液收集于25 mL量瓶中，加水1.25 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.3 系统适用性和专属性试验 精密量取上述对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按2.1项色谱条件测定，理论塔板数结果为6454，供试品溶液色谱图中多拉菌素峰与对照品溶液色谱保留时间一致(图1)。结果表明，系统适用性可以满足检测要求，供试品中其他成分对多拉菌素定量检测无干扰，专属性能满足检测要求。

图1 专属性试验色谱图(A、B、C分别为多拉菌素对照品、 鲁抗舍里乐药业多拉菌素注射液供试品、 鲁抗舍里乐药业多拉菌素注射液辅料)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test

2.4 线性关系考察 取多拉菌素对照品贮备液(浓度约1 mg/mL)，分别精密吸取适量，配制浓度约0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的系列溶液，按上述色谱条件，分别进样20 μL，测定峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，以进样浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程y= 4E+07x+ 56549(R2=1)，结果表明进样浓度在0.01～0.8 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 准确度 采用加标回收的方法，在空白辅料溶液中，按工艺加入一定质量的多拉菌素对照品，分别配制80%、100%、120%浓度的多拉菌素注射液，分别制备3份。按2.1项色谱条件测定峰面积，计算平均回收率及RSD(表1)。结果表明：在三个浓度水平下，多拉菌素注射液回收率为100.2%，符合注射液回收率98%～101%的范围要求，证实了该方法具有良好的准确度。

表1 回收率试验结果Tab 1 Result of recovery test

2.6 精密度

2.6.1 仪器精密度 取2.2.1项对照品溶液，精密量取20 μL，按2.1项色谱条件重复进样6次，测得多拉菌素峰面积RSD为0.2%，表明仪器有良好的精密度。结果见表2。

表2 仪器精密度试验Tab 2 Result of instrument precision test

2.6.2 重复性 取供试品(批号为1812002)注射液，按2.2.2项方法配制6份样品溶液，按2.1项色谱条件，每份样品进样2次，结果含量平均值为104.6%，RSD为0.9%。结果见表3。

表3 重复性试验Tab 3 Result of repeatability test

2.6.3 中间精密度 取供试品(批号为1812002)注射液，换由另一位操作者按2.2.2项方法配制6份样品溶液，选用Waters Alliance E2695液相色谱仪，Waters X-bridge C18色谱柱按2.1项色谱条件，每份样品进样2次，结果含量平均值为103.8%，RSD为0.6%。结果见表4。

表4 中间精密度试验Tab 4 Result of intermediate precision test

2.7 耐用性

2.7.1 不同品牌固相萃取小柱耐用性试验 取供试品溶液按照2.2.2项方法考察市面上在售的两款固相萃取小柱：①SupelcleanTMLC-Si 6 mL(500 mg)SPE Tubes；②Waters Sep-Pak Vac 6cc(500 mg)Silica Cartridges。测定结果详见表5。由表5可见，两个厂家的固相萃取柱对含量测定的结果差异不显著。市售的这两款固相萃取柱均能满足实验要求。

表5 不同固相萃取柱测定多拉菌素含量Tab 5 Determination of Doramectin content by different SPE columns

2.7.2 方法耐用性试验 取1812002批样品(50 mL∶0.5 g)，按2.2项下方法制成供试品溶液，将色谱条件微小变动进行测试，考察方法的耐用性。结果表明该方法能够耐受不同色谱柱、柱温、流速等因素的小范围变化，测得多拉菌素注射液中多拉菌素的含量无明显差异，说明耐用性良好，结果见表6。

2.8 稳定性试验 取供试品(批号为1812002)的样品，按2.2项下方法制成供试品溶液，立即测定，再在2、4、8、12、16、20、24 h的时间点进行测定，所测峰面积均与0 h比较，12 h内相对偏差小于1%，提示样品应在12 h内完成检测。结果详见表7。

表6 色谱条件微小变动后的结果Tab 6 Results of minor changes in chromatographic conditions

表7 稳定性试验Tab 7 Stability test

2.9 样品含量测定 取不同厂家的样品，按2.2项下方法制成供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，上机测定峰面积，通过外标法计算多拉菌素的含量，多拉菌素均在标示量的90.0%～110%。结果见表8。

表8 不同厂家样品测定结果Tab 8 Results of samples from different manufacturers

3 讨论与结论

3.1 色谱条件的选择与确定 研究过程中对样品的溶剂及色谱条件中流动相、检测波长、柱温、流速进行了严格的选择性考察。研究表明，甲醇-乙腈-水(67：15：18)作为流动相，1.0 mL/min的流速在245 nm波长下色谱峰分离效果好，峰形较好[4-6]。

3.2 样品前处理方法的选择 多拉菌素注射液性状为无色或微黄色澄明油状液体，是一类抗寄生虫药[7-9]。参考2017版《兽药质量标准》化学品卷多拉菌素注射液含量测定项下前处理方法，本研究采用固相萃取小柱进行样品的前处理，降低了样品的基质背景，净化和富集了目标化合物，提高了样品分析结果的可靠性和灵敏度[10-11]。结果证明该方法能够较为完全地提取出多拉菌素注射液中的多拉菌素，并且方法的准确度、精密度、稳定性和耐用性均能达到检测的要求[12-13]。

3.3 固相萃取小柱的选择与启示 固相萃取技术与传统的液液萃取法相比，可提高药物回收率，能更加有效的将药物与干扰组分分离。商品化的固相萃取小柱(SPE柱)能够实现多样品的平行处理，大大提高检测的灵敏度。当液体样品溶液通过固相吸附层时，被测物被富集，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。需要注意的是：在选择固相萃取柱时，要考虑固相吸附层的吸附能力，避免实际操作时出现过载现象。SPE柱应用于多拉菌素注射液等油性兽药产品时，能够有效的将有效成分与杂质进行分离，并且重现性较高[14]。以往的研究中SPE柱多用于兽药残留的检测，本试验对于其他分离效果不理想的兽药产品的检测提供了新的思路。

用高效液相色谱法测定多拉菌素注射液中多拉菌素的含量时，采用固相萃取小柱进行前处理，方法简便，准确，回收率高，可有效控制该制剂中多拉菌素的含量。