王长江，曲光刚,*，武曰星，管宇，魏凤，侯运专，赵中伟，沈志强,*

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；3.华中农业大学，武汉 43000)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子呈二十面体对称结构，无囊膜，其基因组为单股环状负链DNA[1]。PCV2是引起猪皮炎肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征和母猪繁殖障碍等相关综合征的致病原[2-3]。PCV2和由它引发的疾病每年给养猪业造成巨大经济损失，严重阻碍了我国养猪产业的发展[4-5]。因此，研制抗PCV2的特异性抗体对于探索PCV2的快速诊断及治疗具有重要意义。

1993年，比利时学者Hamers-Casterman等报道骆驼中存在天然缺失轻链的重链抗体[6]，随后发现在羊驼和一些软骨鱼等动物体内也存在类似的抗体[7-8]。克隆重链抗体的可变区可得到只由一个重链可变区构成的单域抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)[9]，由于VHH相对分子质量约为15 kD，仅为常规抗体的1/10，因此也被称为纳米抗体，它是目前天然来源的相对分子质量最小的抗体[10]。纳米抗体由于其理化性质稳定[11]、易于基因操作和克隆[12]等优势，在疾病诊断、分子检测和治疗等方面受到广泛关注。目前纳米抗体主要通过噬菌体展示技术获得[13]，该技术通过PCR扩增出抗体的全套可变区基因，并将其克隆到噬菌粒载体上，利用E.coli构建包含纳米抗体全部基因序列的抗体文库；辅助噬菌体感染纳米抗体文库后释放包含有重组噬菌粒的噬菌体，形成噬菌体抗体文库，VHH表达在重组噬菌体表面，该技术将表型与基因型直接联系在一起，将抗体识别抗原的能力与噬菌体扩增的能力结合在一起[14]，对特异性抗体的筛选更为高效；噬菌体抗体库技术与杂交瘤单克隆抗体技术相比操作更为简便，因此在生物技术领域极具应用前景[15]。本研究利用分子生物学技术构建了PCV2特异性纳米抗体文库，并对文库相关指标进行了鉴定分析，为进一步研究筛选抗PCV2特异性纳米抗体奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年羊驼1只，此前未经过任何主动免疫(山东绿都生物科技有限公司饲养)。

1.2 主要试剂E.coliTG1菌株、pCANTAB 5E载体由山东省滨州畜牧兽医研究院购买保存；PCV2全病毒灭活疫苗由山东绿都生物科技有限公司提供；Ficoll-paque plus 购自GE公司；总RNA提取试剂盒(RNeasy Plus Mini Kit)和DNA纯化回收试剂盒购自QIAGEN公司；反转录试剂盒为赛默飞公司产品；2×Taq PCR MasterMix 为天根公司产品；SfiI、NotI限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自NEB；琼脂糖为Biowest产品；核酸提取试剂、甘油购自索莱宝生物科技有限公司；氨苄西林钠、硫酸卡那霉素均购自Sigma公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均为OMEGA公司产品；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 引物设计 根据Maass和Harmsen等[9-10,16]文献报道使用的引物并做适当修改，设计两对特异性的引物扩增羊驼重链抗体基因片段。文库构建及鉴定所用引物如表1所示。其中VHH1-F位于抗体编码区的前导序列保守区，VHH1-R位于抗体CH2结构域高度保守区，该对引物用于扩增大小分别为900 bp的vh-CH1-CH2片段和约700 bp的vhh-CH2片段；VHH2-F和VHH2-R用于从700 bp的vhh-CH2片段中扩增得到约400 bp的羊驼重链抗体重链可变区vhh片段，两对引物分别在抗体结构中的位置如图1所示。VHH-Detc-F、VHH-Detc-R为pCANTAB 5E载体上的通用引物，用于文库质量的PCR鉴定。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 文库构建及鉴定引物Tab 1 Primers used for library construction and characterization

图1 vhh扩增引物在IgG抗体结构所在位置示意图[17]Fig 1 Diagram of the location of vhh amplification primers in IgG antibody structure[17]

1.4 方法

1.4.1 羊驼免疫及外周血淋巴细胞分离 将PCV2全病毒灭活疫苗通过背部皮下多点注射的方式对羊驼进行免疫，共免疫4次，免疫间隔为14 d；每次免疫结束后跟踪观察注射包块吸收情况以及羊驼健康状态。第4次免疫结束后1周采血，采用ELISA方法检测免疫抗体效价。通过颈部静脉采集羊驼外周血20 mL，通过密度梯度离心方法分离外周血淋巴细胞，计数后直接用于提取总RNA，剩余细胞沉淀于-80 ℃冻存。

1.4.2 淋巴细胞总RNA提取及cDNA合成 使用QIAGEN总RNA提取试剂盒(RNeasy Plus Mini Kit)提取淋巴细胞总RNA，具体操作参照试剂盒说明书进行。总RNA使用NanoDrop 2000测定浓度后，直接用于反转录合成第一链。

使用Thermo反转录试剂盒进行cDNA第一链合成，反应体系为：总RNA 2 μL、Oligo(dT)181 μL、nuclease-free water 9 μL；65 ℃ 5 min，然后立即在冰上冷却；再向以上反应体系中加入5×Raction Buffer 4 μL、Ribolock RNase Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAid M-MuLV RT 1 μL；42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，10 ℃保存；反应结束后cDNA于-80 ℃保存或立即用于第一轮PCR反应。

1.4.3vhh基因扩增 利用巢式PCR通过两轮PCR反应扩增羊驼重链抗体的可变区编码基因，第一轮PCR反应以cDNA作为模板，使用VHH1-F和VHH1-R引物进行扩增反应，反应程序为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30个循环，72 ℃ 10 min。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切取约700 bp片段，使用OMEGA胶回收试剂盒回收纯化目的片段。

第一轮PCR产物适当稀释后作为第二轮PCR反应的模板，使用引物VHH2-F和VHH2-R进行扩增反应，反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30个循环，72 ℃ 10 min。使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带，预期条带大小约400 bp。使用胶回收试剂盒回收纯化目的条带，于-20 ℃保存备用。

1.4.4 噬菌粒重组载体构建 将vhh目的基因片段与pCANTAB 5E噬菌粒载体分别使用SfiI和NotI限制性内切酶双酶切，经琼脂糖凝胶回收；使用T4DNA连接酶将纯化的vhh目的基因片段与双酶切处理后的噬菌粒载体pCANTAB 5E连接。将连接产物经电穿孔法转入新制备的E.coliTG1感受态细胞中，电穿孔仪设置电压为1.8 kV，电转化完成后37 ℃ 200 r/min振荡培养1 h，取100 μL进行梯度稀释计算电转化效率；剩余菌液涂布氨苄抗性固体平板，30 ℃过夜培养。

1.4.5 纳米抗体文库的库容及多样性鉴定 使用LB培养基冲洗平板上固化的菌落并收集到250 mL灭菌锥形瓶中，取100 μL菌液进行梯度稀释后涂布氨苄抗性平板，过夜培养后计数各稀释度平板上的菌落数，根据菌落数及稀释倍数计算抗体文库的库容；随机挑取50个单菌落分别于5 mL LB培养基中过夜培养，以过夜培养的菌液作为模板，使用VHH-Detc-F和VHH-Detc-R引物进行PCR反应，鉴定阳性克隆比例。将阳性克隆菌提取质粒后送上海生工生物工程有限公司测序，鉴定抗体文库基因序列多样性。剩余菌液加入终浓度为20%的甘油，混匀后分装，于-80 ℃冻存。

2 结果与分析

2.1 PCV2灭活全病毒免疫羊驼后血清抗体效价

第4次免疫结束1周后采血分离抗血清，进行倍比稀释，以PCV2 Cap蛋白包被ELISA 96孔板，以免疫PCV2全病毒灭活疫苗前分离的羊驼血清500倍稀释后作为阴性对照，通过间接ELISA方法检测免疫后羊驼血清IgG抗体水平。结果显示，第4次免疫后，羊驼血清PCV2 IgG抗体效价可达1∶50000以上(图2)，血清抗体水平符合构建纳米抗体文库标准。

图2 PCV2灭活全病毒免疫羊驼后血清抗体效价Fig 2 Serum antibody level of alpaca after immunized with PCV2 inactivated virus

2.2 外周血淋巴细胞分离及总RNA提取 使用淋巴细胞分离液从20 mL羊驼抗凝外周血中分离到约7.5×107单个核细胞。使用QIAGEN总RNA提取试剂盒提取的RNA总量为25.9 μg，A260 nm/A280 nm值为1.99，满足建库要求。剩余淋巴细胞于-80 ℃冻存备用。

2.3vhh目的基因扩增 以制备的cDNA为模板，使用VHH1-F和VHH1-R引物进行第一轮PCR扩增反应，PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图3。第一轮PCR产物包括大小分别为900 bp和700 bp的两种特异性片段。

M: DL2000 Marker；ctrl: PCR阴性对照；1-2: 第一轮PCR产物 M: DL2000 Marker; ctrl: PCR negative control; 1-2: the first round PCR products图3 第一轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig 3 Agarose gel electrophoresis of the first round PCR products

割胶回收第一轮PCR产物中的700 bp片段，纯化后以此为模板，使用VHH2-F和VHH2-R引物进行第二轮PCR扩增反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示，第二轮PCR产物大小约为400 bp(图4)，与预期片段大小一致。

M: DL2000 Marker；N1～N2: PCR阴性对照； 1-2: 第二轮PCR产物 M: DL2000 Marker; N1～N2: PCR negative control; 1-2: the second round PCR products图4 第二轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig 4 Agarose gel electrophoresis of the second round PCR products

2.4 pCANTAB-vhh重组质粒构建 第二轮PCR产物经纯化后与噬菌粒载体pCANTAB 5E分别经SfiI和NotI限制性内切酶双酶切，使用DNA纯化回收试剂盒回收双酶切后的vhh目的片段和pCANTAB 5E载体，定量后使用T4 DNA连接酶连接过夜。连接产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示连接产物包含大小分别为约7000 bp和5000 bp的两条带(图5)。其中5000 bp条带与重组质粒预期大小一致，可判断vhh目的基因与pCANTAB 5E载体连接成功。

M: 1 kb ladder；1: 双酶切后的pCANTAB 5E载体； 2: vhh与pCANTAB 5E连接产物 M: 1 kb ladder; 1: double-digested pCANTAB 5E vector; 2: ligation product图5 连接产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig 5 Agarose gel electrophoresis of ligation product

2.5 纳米抗体文库阳性率、库容鉴定 将连接产物通过电穿孔转入新鲜制备的E.coliTG1感受态细胞中，电转化后获得转化子数为1.34×108CFU/mL，转化效率约1.5×108CFU/μg DNA。转化子涂布氨苄抗性平板，30 ℃过夜培养后收获平板上的菌落，最终收获转化重组子数为3.01×1010CFU/mL。从稀释后菌液涂布的抗性平板上随机挑取50个单菌落进行PCR鉴定，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示其中有4个为阴性(图6，26号、29号、32号和43号)，其余均扩增出约700 bp的预期大小条带(图6)，阳性率为92.0%，计算最终库容大小为2.77×1010CFU/mL。

M: DL2000 Marker；ctrl: PCR阴性对照；1-50: 菌液PCR结果 M: DL2000 Marker; ctrl: negative control; 1-50: PCR products of randomly picked colonies图6 纳米抗体文库菌液PCR鉴定结果Fig 6 PCR identification results of nanobody library

2.6 纳米抗体文库多样性鉴定 对鉴定为阳性的菌液提取质粒后测序，并将测序结果分别与NCBI数据库进行BLAST比对分析，结果显示所有匹配序列均为羊驼或骆驼重链抗体可变区序列，序列一致性比率在79%～97%之间，表明该抗体文库为重链抗体基因文库。测序序列之间比对结果如图7所示，16个测序序列均为独立克隆，其CDR3区的氨基酸种类和包含的氨基酸残基数均有较大差异，表明该纳米抗体文库基因序列中CDR3区氨基酸序列种类丰富，所构建的PCV2纳米抗体文库具有很好的多样性。其中编号为01、02、03和10的测序序列，CDR3区包含20个以上的氨基酸残基，符合纳米抗体具有较长CDR3区的典型特征；另外，所有测序序列的第39位、第46位、第47位和第49位氨基酸残基种类符合纳米抗体的氨基酸结构特征[18]，进一步证明了所构建的抗体文库确为纳米抗体文库。

“.”表示该序列氨基酸与首行序列完全相同；“-”表示该位置氨基酸缺失；英文字母表示测序序列在该位置氨基酸残基具有差异 “.” represents that the amino acids of all sequences in this site are the same; “-” represents that there are amino acids deletion in this site; Letters represent that the amino acids in this site are different图7 纳米抗体文库序列多样性分析Fig 7 Sequence diversity analysis of PCV2 nanobody library

3 讨论与结论

PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等相关疾病的主要病原[19]，PCV2及其导致的多种病原体的共同感染每年给养猪业造成巨大经济损失。目前虽已有各种类型的疫苗用于PCV2的防控，但是建立高效的PCV2感染的检测方法对PCV2的综合防控同样具有重要意义。近年来已有许多国内外学者开展了PCV2单克隆抗体的研制工作[20-22]，与传统多克隆抗体和单克隆抗体相比，纳米抗体相对分子质量更小、特异性和稳定性好、制备周期相对较短、在识别传统抗体无法识别的隐蔽表位或小表位等方面更具优势。本研究构建了高质量纳米抗体文库，为筛选抗PCV2特异性纳米抗体提供原始材料。

根据抗体基因来源动物是否经过免疫，纳米抗体文库可分为免疫抗体文库和非免疫抗体文库[23]，本研究构建的特异性纳米抗体文库来源于经PCV2免疫的羊驼，属于免疫抗体文库。动物免疫后血清抗体水平反映了特异性抗原激发免疫反应的程度，同时也能间接反映经特异性抗原介导活化、增殖的淋巴细胞的数目。本研究分离免疫羊驼外周血淋巴细胞后，通过巢式PCR扩增出vhh目的基因片段，并将其克隆到pCANTAB 5E载体上，连接产物琼脂糖凝胶电泳结果出现两条带，推测是由于重组质粒的构象差异导致在凝胶中的迁移速率不同所致。

本研究所构建的纳米抗体文库，文库菌阳性重组率为92.0%，符合纳米抗体文库质量要求；16个随机测序序列均为独立克隆，与NCBI数据库进行BLAST比对分析，结果显示目的基因均与羊驼或骆驼重链抗体重链可变区序列特征匹配，表明本研究所构建的抗体文库为重链抗体基因文库；在结构方面，纳米抗体的典型特征之一是具有较长的CDR1和CDR3，CDR3平均长度为16～18个氨基酸[24-25]，较长的CDR3有助于维持纳米抗体结构的稳定性、增加其特异性和亲和力。与传统抗体相比，纳米抗体在FR2区存在4个特征性氨基酸，Phe/Tyr39、Glu/Gln46、Arg47和Gly/Phe/Leu49，这四个特征性氨基酸残基能够阻止VH与VL结合，增加纳米抗体的可溶性、降低其聚合性[6, 25]。本研究中随机挑取的16个单克隆的氨基酸序列符合纳米抗体的氨基酸序列结构特征，纳米抗体文库包含序列多样性良好。

纳米抗体文库的库容大小、抗体基因多样性是衡量抗体文库质量的重要指标[26]，对后续淘洗出的特异性纳米抗体的亲和力具有决定作用[27]。对于天然抗体库而言，淘洗到高亲和力抗体(Kd10-8～10-10M)要求库容达到109以上[28]；而免疫库中包含的可变区基因是经过重排及亲和力成熟后的序列，与非免疫抗体文库相比，淘洗到高亲和力纳米抗体对库容要求相对较低。本研究构建的纳米抗体文库库容达到2.77×1010CFU/mL，文库包含大量已经被诱导的PCV2特异性抗体基因，抗原针对性强，有助于淘洗到高亲和力PCV2特异性纳米抗体。

综上所述，本研究成功构建了羊驼来源的PCV2特异性纳米抗体文库，并对文库库容和序列多样性进行了鉴定，为进一步筛选抗PCV2相关抗原的高亲和力纳米抗体奠定了基础。