沙万里, 闫满，丛薇，刘东旭，尹柏双，李国江*

(1.吉林农业科技学院，吉林吉林 132101；2.吉林省预防兽医学重点实验室，吉林吉林132101； 3.永吉县动物疫病预防控制中心，吉林吉林132100)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是导致仔猪腹泻死亡的主要原因之一，2012 -2017年全国各地区呈爆发趋势且防治效果不明显[1]。PED最明显特点是3～7日龄新生仔猪高发，临床表现为严重腹泻、呕吐、脱水，是致死率极高的肠道传染病[2]。由于猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)为有囊膜不分节段单股正链RNA的结构特点[3]，研究发现S基因存在核苷酸插入与缺失及氨基酸突变、ORF3基因存在氨基酸变异[4-5]。部分地区PEDV流行株调查情况显示，国内大部分流行株亲缘关系较近，与疫苗株CV777、中国早期分离株CH/S、韩国流行株DR13、泰国流行株TH/AY/2.7/12、日本株14JM/01等亲缘关系较远[6]，这可能是导致疫苗免疫效果不佳、PED暴发流行的主要原因。本研究通过PEDV胶体金试纸、RT-PCR检测及临床症状与病理剖检相结合作为诊断方法，通过筛阳性样本制备小肠组织灭活液，与原使用疫苗对比，评价免疫效果，为进一步验证PEDV流行株的遗传变异和分析PED的暴发流行及提供紧急防治措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源及实验动物 样品来自2016年1月-2018年5月间，分布在吉林市、永吉、桦甸、舒兰、蛟河、磐石地区3～7日龄仔猪发生严重腹泻、呕吐、脱水和死亡的30个猪场150份完整肠道样本，保存于吉林农业科技学院(吉林省猪生态养殖及疫病防控科技创新中心)-80 ℃冰箱；清洁级昆白鼠30只；产前90 d妊娠母猪72头(校企合作产学研基地PEDV阳性场)。

1.2 主要试剂 PEDV胶体金检测卡(韩国金诺)、组织DNA/RNA基因组通提试剂盒(日本TaKaRa9766)、反转录试剂盒(TaKaRa 6210A)、EX Tap聚合酶(日本TaKaRa)、琼脂糖(西班牙BIOWEST)；PDEV ELISA抗体检测试剂盒(北京飞凯)、50×TAE(北京博奥拓达)、0.9%生理盐水、0.4%甲醛、双抗、LB培养基等均为国产化学试剂。

1.3 PEDV胶体金试纸检测 将病料置于4 ℃条件下解冻，用棉签采集肠内容物放入PEDV检测样品稀释管(含稀释液)中充分混匀，吸取上清液4～5滴至试纸条加样孔中，室温条件下5 min内观察结果。判定标准：C处出现红色条带检测卡有效，T处出现红色线条带判定PED阳性。

1.4 PEDV RT-PCR检测

1.4.1 引物设计 参考 GenBank 中公布的 PEDV CV777 毒株全基因序列(登录号为 AF353511)，通过软件设计1对引物用于扩增ORF3基因，将其命名为PED-ORF3U1/L1，目的扩增基因片段长度为792 bp，引物由博仕生物技术有限公司合成，引物信息见表1。

表1 PEDV CV777 ORF3引物信息Tab 1 Primer information of PEDV CV777 ORF3

1.4.2 病毒RNA提取与cDNA合成 将保存的病料反复冻融(解冻条件为4 ℃)三次，取小肠组织及内容物20 mg，按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0方法提取样品总RNA，置于-80 ℃保存。cDNA 的合成体系：Primescript RT Enzyme Mix 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×Primescript Buffer 4 μL、RNase Free ddH2O 4 μL、总RNA产物10 μL，最终总体系为20 μL，37 ℃孵育15 min。获得的cDNA模板置于-80 ℃保存。

1.4.3 RT-PCR扩增 以合成的cDNA模板进行PDEV ORF3基因扩增，根据引物设计预期基因片段长度为792 bp。PCR反应体系：Premix Taq DNA酶12.5 μL、PEDV-ORF3 U1 2 μL、PEDV-ORF3 L1 2 μL、cDNA模板2.5 μL、ddH2O 6 μL，反应总体系为25 μL。扩增反应条件：45 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃ forever。取扩增产物3 μL上样3%琼脂糖凝胶孔，电泳电压条件150 V。

1.5 小肠组织灭活液免疫效果分析

1.5.1 抗原灭活 按照病料来源分类，选取PEDV双鉴定法阳性病料整段小肠及内容物，按照病料重量与无菌生理盐水(0 ℃预冷)1∶10比例5000 r/min匀浆，16层纱布无菌条件下过滤3次，0.4%比例加入甲醛充分混匀，37 ℃转瓶灭活48 h，按1500 UI/mL体积比加入双抗液(青霉素和链霉素)混匀，分装后-20 ℃保存备用。取上述灭活液5 μL分别接种LB固、液培养基，37 ℃ 48 h进行无菌检验。以0.5 mL、1.5 mL、3 mL剂量分别注射5只昆白鼠，同剂量生理盐水注射组为对照，进行安全性评估。

1.5.2 免疫效果分析 选取3个防控无明显效果且准备进行返饲的校企合作产学研基地PEDV阳性场，依次命名为A、B、C，24头/场，每组12头：a1-12原疫苗组、b1-12组织灭液组。分别于产前70 d、35 d后海穴注射4 mL/头，产前2 d采集静脉血，分离血清-20 ℃保存。参照PDEV ELISA抗体检测试剂盒说明书进行抗体水平测定，结果判定：OD阳性对照≥0.4试验有效，临界值=0.3*OD阳性对照，OD样本≥临界值为阳性。新生仔猪发病率=(发病数/同组总头数)×100%、新生仔猪死亡率=(死亡数/同组总头数)×100%。

2 结果与分析

2.1 PEDV检测结果 结合临床和病理剖检(图1)、PEDV胶体金试纸及RT-PCR检测结果综合判定。在试纸卡中C、T位置出现红色条带证明PEDV阳性(图2)，RT-PCR扩增产物经凝胶电泳在792 bp处出现条带证明PEDV阳性(图3)。疑似PEDV感染场采样统计数据见表2，吉林、永吉、舒兰、磐石、蛟河、桦甸场阳性率依次为100%、100%、80%、80%、80%、60%，样本阳性率依次为92%、84%、68%、76%、76%、56%，总体场阳性率76%，总体样本阳性率75%。

图1 临床症状与病理剖检结果Fig 1 Clinical symptoms and pathological examination results

C：检测对照线；T：样本检测线 C: Test control line; T: Sample line图2 PEDV胶体金试纸检测结果Fig 2 Detection results of PEDV colloidal gold dipstick

M: DNA Marker DL 2000；1-6：检测样本 M: DNA Marker DL 2000；1-6：Test sample图3 PEDV胶体金试纸检测结果Fig 3 Detection results of PEDV colloidal gold dipstick

表2 疑似PEDV感染场检测结果数据统计Tab 2 Statistics of detection results of suspected PEDV infection field

2.2 PDEV ELISA抗体检测结果 抗体检测结果如表3所示，三个试验场组织灭活液组抗体平均值、标准差、阳性率均高于原疫苗组，而A场和C场离散度高于原疫苗组、B场低于原疫苗组，总体数据折线图(图4)表明，组织灭活液组抗体平均水平高于原疫苗组。

表3 PEDV ELISA抗体检测结果Tab 3 Results of antibody detection by PEDV ELISA

图4 PEDV总体抗体水平趋势Fig 4 All trend of antibody level of PEDV

2.3 预防效果 使用来源于各自养殖场内病料制备的小肠组织灭活液与原疫苗免疫进行对比分析，统计数据表明(表4)，A场发病率从68.5%下降到8.5%，死亡率从60.1%下降到8.5%；B场发病率从71.4%下降到16.1%，死亡率从68.3%下降到16.1%；C场发病率从58.7%下降到7.7%，死亡率从53.1%下降到7.7%。

表4 新生仔猪发病率、死亡率Tab 4 Morbidity and mortality of newborn piglets

3 讨论与结论

仔猪感染PEDV在诊断过程中需要综合考虑各种因素。RT-PCR是目前普遍采用的一种分子生物学检测技术，具有快速、灵敏、特异等优点，但是通过复检各地区部分检测结果时，假阴、阳性的问题一直存在，在该流程中人为操作、主观判断、核酸污染等均可影响结果准确性。目前，胶体金试纸技术非常成熟，在应用过程中具有简便、快速、直观等优势，但与RT-PCR检测结果复核时也存在一定差别。PED临床症状和病理变化[7]较为典型，在此基础上结合上述检测方法，可提高PED临床诊断准确性，实现及时预警，可有效防控PED流行与爆发，减少养殖企业经济损失。

全国各地区PEDV流行毒株与参考毒株ORF3和S基因同源性与系统进化研究结果表明，S基因存在核苷酸缺失、变异及突变，毒株之间存在部分差异[8-9]，与本研究中抗体检测结果相互验证，解释了应用参考株疫苗虽然产生了抗体，但达不到预期免疫保护效果，而免疫灭活液却效果显著这一问题。

本试验制备的免疫灭活液是自家苗的一种，具有高度同源性，解决了血清型不同和病原变异这一主要矛盾。当某些种类疫病爆发且无有效防治方法时，自家苗可作为一种紧急防治措施控制疫情。但值得注意的是，虽然临时使用自家苗起到了明显的防治效果，相对于返饲又具有较好的生物安全性，但是自家苗的病毒效价、注射剂量、免疫麻痹、含多种抗原导致的免疫应激、非目标病原以及杂质废物等对机体的负面影响是需要慎重考虑的。建议在疫病防控中通过基因型比对等方法及时配型，使用标准化商用疫苗实现疫情的有效防控。

本研究结果表明，针对爆发PED且无有效防治效果，应用来源于场内小肠组织病料重量与无菌生理盐水(0 ℃预冷)1∶10比例、0.4%甲醛灭活48 h、1500 UI/mL双抗制备的灭活液产前70 d、35 d后海穴注射4 mL/头免疫妊娠母猪，可作为紧急防治措施有效防控PED疫情。