李松磊　李倩如

【摘 要】目的：探究輔助性T（Thelper，Th）细胞22细胞在不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）中的作用及其与Th17细胞之间的关系。方法：选择2016年10月至2018年5月在郑州大学第三附属医院妇产科门诊就诊的30例不明原因复发性流产患者为URSA组，选择同期在本院行人流术的30例正常早孕妇女为对照组。采用流式细胞仪检测两组孕妇外周血中Th22细胞和Th17细胞的数量，采用酶联免疫吸附试验检测两组孕妇血浆中白细胞介素（interleukin，IL）-22和IL-17A的浓度的变化。结果：与对照组相比较，URSA组患者外周血中Th22细胞的数量和Th17细胞的数量显著增多，血浆中IL-22和IL-17A的浓度同样显著升高;在URSA组中，Th22细胞数量与Th17细胞数量呈正相关，而在对照组中，未见明显相关性;在URSA组中，IL-22的浓度不仅与Th22细胞的数量呈正相关，也与Th17细胞的数量呈正相关，但与Th22细胞的关联强度较高。结论：Th22细胞的数量及其效应因子IL-22浓度的显著增高可能与URSA具有一定相关性，同时在URSA中，Th22细胞与Th17细胞呈相关，提示两种细胞的分化成熟，可能相互影响。

【关键词】T淋巴细胞;不明原因复发性流产;白细胞介素

Study on the roles of Th22 cells and cytokines in unexplained recurrent spontaneous abortion

Li Songlei1，2， Li Qianru*1

1.School of Basic Medical Sciences， Zhengzhou University， Zhengzhou， Henan 450000;

2.Department of Clinical Laboratory， the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou， Henan 450000

[Abstract] Objective：To investigate the role of Th22 cells in unexplained recurrent spontaneous abortion and its relationship with Th17 cells. Methods： Thirty women with unexplained recurrent spontaneous abortion in the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University from October 2016 to May 2018 were enrolled as URSA group. Thirty healthy pregnant women were selected as control group. Flow cytometry was used to detect the frequencies of Th22 cells and Th17 cells in the peripheral blood of the two groups. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the changes of IL-22 and IL-17A in the plasma of the two groups. Results： The percentages of Th22 and Th17 cells in peripheral blood of URSA patients were significantly increased than those in the control group， and the plasma concentrations of IL-22 and IL-17A of URSA patients were also significantly increased than those in the control group. There was a positive correlation between the Th22 and Th17 cells in the URSA group， but not in the control group. In the URSA group Positive correlation was found in the plasma concentration of IL-22 with Th22 cells， and also with Th17 cells. But the intensity of correlation with Th22 cells is relatively high. Conclusions： Increased frequencies of Th22 cells and high levels of IL-22 may be associated with USRA. And Th22 cells are correlated with Th17 cells， suggesting that the differentiation and maturation of the two cells may interact with each other.

[Key words]T-lymphocytes; Unexplained recurrent spontaneous abortion; Interleukins

自然流产是一种常见的妊娠期并发症，影响着约50%～60%的正常妊娠，据估计，有1%～3%的女性在妊娠20周以前经历过3次或者3次以上的流产，这就被称为复发性流产[1]。目前研究认为，复发性流产与染色体的异常、激素的异常分泌、子宫的畸形、感染、自身免疫性疾病等多种因素相关[2]。但是，以上机制仅能解释少于50%的復发性流产，有大约60%复发性流产的发生不能用上述机制进行解释，称为不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[3]。有资料显示，在很大程度上，不明原因复发性流产与免疫系统的异常调控密切相关[4]。其中，CD4+T淋巴细胞各亚群介导的免疫反应在不明原因复发性流产病因学中的作用是研究热点之一[5]。

CD4+T淋巴细胞根据其转录因子和分泌的细胞因子的不同被分为Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Th22细胞、Th9细胞和Treg细胞[6]。已有研究证实，Th1细胞与Th2细胞之间的免疫失衡，Th17细胞和Treg细胞之间的免疫失衡与不明原因复发性流产密切相关[7-8]。Th22细胞是新近报道的CD4+T淋巴细胞亚群，主要分泌细胞因子IL-22，不分泌细胞因子IFN-γ和IL-17，是一种在功能上和基因表达上独立的细胞亚群，在皮肤稳态的维持、自身免疫性疾病、炎症性疾病和癌症等多种疾病的发病中的发挥关键作用[9-11]。然而，关于Th22细胞及其效应细胞因子IL-22在生殖系统的研究甚少，故本研究通过检测不明原因复发性流产患者外周血中Th22细胞及Th17细胞的数量变化，以及血浆中细胞因子IL-22和IL-17A浓度的变化，初步探讨Th22细胞在不明原因复发性流产中的作用及其与Th17细胞之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2016年10月至2018年5月在郑州大学第三附属医院妇产科门诊就诊的30例早期自然流产患者为URSA组，平均年龄为（29.00±2.45）岁，平均孕周为（8.69±1.22）周，以往均无活产史，B超未见胚胎心管搏动，孕期未使用黄体酮等药物治疗。选择同期在本院行人流术的正常早孕妇女30例为对照组，平均年龄为（26.16±3.14）岁，平均孕周为（9.12±1.09）周。URSA组患者纳入标准：1）有连续3次或3次以上的自然流产史;2）年龄小于40岁;3）夫妇双方无染色体异常;4）性激素检查，甲状腺功能检查，血糖，胰岛素检测及凝血功能检测均正常;5）白带常规、B超或子宫输卵管造影等检查排除生殖器官器质性病变，解剖畸形以及感染因素;6）宫颈分泌物培养排除支原体，衣原体等感染;7）TORCH IgM检查均为阴性;8）抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体、抗精子抗体、抗核抗体（ANA）、抗甲状腺抗体（TPO-Ab、TG-Ab）等自身抗体均为阴性;9）男方精液分析正常;10）既往未接受过主动免疫治疗。对照组纳入标准：以往无自然流产史、死胎、死产史，排除染色体及生殖器官解剖异常、内分泌紊乱、自身免疫性疾病等疾病。有正常足月分娩一次以上。本次妊娠期间无腹痛及阴道出血，B超提示胚胎发育正常。研究经本院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。两组孕妇的年龄和孕周相比较，差异均无统计学意义（P>0.05），可比较。

1.2 研究方法

1.2.1 标本的采集 两组孕妇于入组时空腹状态下采集静脉血4mL，置于肝素钠抗凝管中，其中2mL全血用于流式细胞检测，2mL分离血浆于-80℃保存用于细胞因子检测。

1.2.2 流式细胞术测定外周血中Th22细胞和Th17细胞的比例 取250μL肝素钠抗凝全血，与250μL RPMI1640培养基（不含小牛血清）充分混匀后，加入1μL淋巴细胞刺激剂，于37℃ 5% CO2培养箱中孵育培养6h。培养后，取100μL细胞悬液，加入FITC标记的抗人CD3和PerCP-Cy5.5标记的抗人CD8a各5μL，室温避光孵育30min，之后加入1mL溶血素，混匀后室温避光10min，用PBS洗涤后加入1mL固定破膜剂，室温避光孵育45min，加入破膜缓冲液洗涤2遍后，加入PE标记的IL-22和APC标记的IL-17A各5μl，室温避光孵育30min，再加入破膜缓冲液洗涤2遍后，加入500μL染色缓冲液，采用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，流式细胞仪检测结果用Flow Jo软件进行分析，结果以Th22细胞和Th17细胞占CD4+T细胞的百分比表示。具体步骤如下：在淋巴细胞群中，以CD4设门，由于淋巴细胞刺激剂中佛波酯的作用会使淋巴细胞表面标志CD4发生内吞效应，因此本研究利用CD3和CD8a反设门CD4，之后再以IL-22和IL-17A的同型对照进行设门，将Th22细胞表示为CD3+CD8a-IL-17A-IL-22+细胞，将Th17细胞表示为CD3+CD8a-IL-17A+细胞。流式抗体、淋巴细胞刺激剂和固定破膜剂均购自美国eBioscoence公司。

1.2.3 酶联免疫吸附试验测定血浆中细胞因子IL-22和IL-17A的浓度 严格按照说明书步骤进行操作，以吸光度（A）为横坐标，以浓度递增的标准品为纵坐标，绘制标准曲线，计算浓度。

1.3 统计学分析

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料采用（±s）表示，组间采用独立样本t检验进行统计学分析，相关性检验采用Pearson相关性分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 URSA组与对照组孕妇外周血中Th22细胞、Th17细胞以及CD4+IL17A+IL-22+双阳性T细胞数量的比较

URSA组孕妇外周血中Th22细胞、Th17细胞和CD4+IL17A+IL-22+双阳性细胞的数量显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1，图1。

图1 两组孕妇外周血中Th22细胞、Th17细胞及CD4+IL17A+IL-22+双阳性T细胞占CD4+T淋巴细胞百分比的流式分析图

2.2 URSA组与对照组孕妇血浆中细胞因子IL-22和IL-17A浓度的比较

URSA组孕妇血浆中细胞因子IL-22和IL-17A的浓度显著高于对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 URSA组和对照组孕妇外周血中Th22细胞和Th17细胞的相关性分析

在URSA组中，Th22细胞的数量与Th17细胞的数量呈正相关（r=0.690，P=0.000），而在对照组中，Th22细胞的数量和Th17细胞的数量无相关性（r=0.269，P=0.204）。

2.4 URSA组中细胞因子IL-22与Th22细胞、Th17细胞的关系

在URSA组中，血浆中IL-22的浓度与Th22细胞的数量呈正相关（r=0.590，P=0.002），同时与Th17细胞的数量也呈正相关（r=0.401，P=0.047）。

3 讨论

从免疫学的观点来看，在人类妊娠中，胎儿携带有父源性基因和抗原，这对母体免疫系统来说是一种半同种异体移植物，因此，正常妊娠的维持必定需要一种保护机制来避免母体免疫系统对胎儿发生排斥反应[12]。一旦这种免疫耐受的保护机制被打破，就会引发病理性妊娠，复发性流产就是一种常见的病理性妊娠。在复发性流产中，URSA占半數以上，然而，该种疾病的发病原因不可得知，因此在该病的治疗和预防上存在较大的难度[13]。有资料显示，免疫系统的调控异常与URSA的发生密切相关，CD4+T淋巴细胞之间的异常作用和细胞因子的分泌紊乱是一个关键因素[5]。研究表明，Th1细胞和Th2细胞之间的免疫失衡与Th17细胞和Treg细胞之间的免疫失衡在URSA中发挥关键作用[14]。本研究重点关注于新近发现的CD4+T淋巴细胞亚群Th22细胞，初步探讨Th22细胞与URSA的关系，以及在URSA中其与Th17细胞的关系。

Th22细胞是Eyerich S等研究者在2009年首次报道的一种新颖的Th细胞亚群，该细胞主要分泌IL-22，但不分泌IFN-γ，IL-4和IL-17，是一种有别于Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞的细胞群体[9]。IL-22是Th22细胞的主要效应分子，IL-22通过与其广泛分布于细胞、组织和器官中的IL-22受体相互作用，在不同的微环境中执行不同的功能[15]。最近的研究证明，滋养细胞上存在IL-22的受体，并且IL-22和其受体结合后可对滋养细胞发挥调控作用，即可促进滋养细胞的增殖、延长滋养细胞的生存时间并抑制滋养细胞的凋亡[16-17]。到目前为止，关于Th22细胞和IL-22与URSA的关系的报道甚少，为了探究Th22细胞与URSA的关系，笔者通过流式细胞仪检测了URSA组和对照组孕妇外周血中Th22细胞的数量，在URSA组中我们观察到数量显著增多的Th22细胞，在外周血中同样检测到浓度升高的IL-22，因此，笔者推测外周血中数量增多的Th22细胞可能与URSA具有一定相关性。但是，Th22细胞和细胞因子IL-22在不同的细胞、组织和器官中具有双重调控作用。研究表明，IL-22可在多种组织中发挥免疫保护的作用，它可以通过诱导皮肤防御素、钙粒蛋白-A和钙粒蛋白-B的表达增加皮肤角质形成细胞的抗菌能力，同时在病毒性肝炎中可保护肝脏细胞并修复肝损伤，此外，在溃疡性结肠炎中，能够加速创面的愈合，发挥保护创面的功能[18-20]。然而，Th22细胞和IL-22并非只发挥免疫保护的功能，研究发现其与多种自身免疫性疾病、炎症性疾病和癌症的发病密切相关[21-22]。有资料显示，IL-22作为促炎性细胞因子参与类风湿关节炎的发病，并且疾病的严重程度与Th22细胞的数量呈正相关[23]。因此，考虑到Th22细胞和IL-22作用的复杂性，本研究仅仅初步观察到了在URSA中，Th22细胞的数量是增多的，至于增多的Th22细胞在URSA中如何发挥作用，仍需深入研究。

关于Th17细胞与URSA关系的报道较多，目前较多的研究认为在URSA患者外周血中和蜕膜中Th17细胞的数量是增多，这与本研究中在URSA患者外周血中所观察到的结果是一致的。Th17细胞数量的增多，其所分泌的细胞因子IL-17A增多，IL-17A作用广泛，可以诱导多种炎性细胞因子（IL-23、IL-6、TNF-α）和多种趋化因子（巨噬细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎性趋化因子-2、基质金属蛋白酶等），这些效应因子可进一步诱发炎症反应，介导组织浸润和组织损伤，从而不利于妊娠的维持[24-25]。此外，本研究重点分析了Th22细胞与Th17细胞的关系，以往的研究表明，Th22细胞与Th17细胞关系密切，在类风湿性关节炎、宫颈癌和再生障碍性贫血等多种疾病中相互影响，表现为共同的变化趋势，在类风湿关节炎中，Th22细胞与Th17细胞的数量均增多，且两者之间存在正相关关系，同时Th17细胞的转录因子RORγt可调控Th22细胞的分化[23，26-27]。在本研究中，笔者应用了pearson相关分析法分析了两组孕妇外周血中Th22细胞与Th17细胞的相关性，发现在URSA组中，Th22细胞的数量与Th17细胞的数量呈明显的正相关，而在对照组中，则没有观察到显著的相关性，因此，笔者推测在URSA中，Th22细胞和Th17细胞的分化成熟，可能相互影响，具有共同的驱动方式。

IL-22是IL-10细胞因子家族中的一员，主要由活化后的T细胞分泌，Th22细胞、Th17细胞、Th1细胞、细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞都可分泌IL-22[28]。有资料显示，在所有分泌IL-22的细胞中，Th22细胞所占的比例最大，为37%～63%，Th17细胞所占的比例是10%～18%[9]。由此可见，Th22细胞是主要分泌IL-22的细胞群体，这就为本研究中观察到URSA患者外周血中的IL-22的浓度与Th22细胞的数量呈正相关提供了支持，由此推测浓度升高的IL-22可能主要来源于Th22细胞。然而，在URSA组中，IL-22的浓度不仅与Th22细胞的数量呈正相关，也与Th17细胞的数量呈正相关，但与Th22细胞的关联系数较大，关联性较强，同时，在URSA组中CD4+IL-17A+IL-22+双阳性细胞（分泌IL-22的Th17细胞）的数量较对照组显著增多，虽然这一细胞群体所占的比例很少，但是这足以说明，在URSA中，除Th22细胞之外，浓度增多的IL-22可能同时来源于Th17细胞，只是Th17细胞所占的比例很小。然而，IL-22与Th22细胞和Th17细胞的关系不仅仅限于此，我们仍然需要进一步去探究IL-22如何在URSA中发挥作用，以及其与其他细胞和细胞因子之间的关系。

綜上所述，Th22细胞的数量及其效应因子IL-22浓度的显著增高可能与URSA具有一定相关性，同时Th22细胞与Th17细胞呈相关，提示两种细胞的分化成熟，可能相互影响，具有共同的驱动方式。此外，在URSA中，IL-22可能同时来源于Th22细胞和Th17细胞，但究竟IL-22是如何发挥作用的，以及其与两种细胞之间的潜在关系，仍需要深入探究。

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