朱丽娟 张振山 夏楠楠 张伟峰 郑晶 孟飞龙 杨磊 沈龙

(1郑州大学附属郑州中心医院风湿免疫科，河南 郑州 450007；2中山大学附属第五医院风湿免疫科；3厦门大学)

原发性干燥综合征(PSS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，临床症状复杂多样，病理表现主要可见大量淋巴细胞浸润外分泌腺及内脏器官。PSS在我国发病率为0.3%～0.7%，多发于30～40岁或绝经女性，其发病机制至今尚不明确〔1〕。PSS在老年人群中致病高达0.77%，严重影响老年人的生活质量〔2〕。微小RNA(miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过与其靶基因3'非翻译区(UTR)区序列结合形成沉默复合物，通过降解其靶基因或抑制其靶基因翻译，参与调节机体生长、发育、细胞衰老、凋亡等多种生物过程〔3〕。研究发现，miRNA可调节机体免疫功能、维持免疫系统稳定，在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用〔4〕。本研究拟观察miR-146a和miR-155在老年PSS患者血清中表达。

1 资料与方法

1.1一般资料 2016年1月至2019年1月郑州大学附属郑州中心医院收集的80例首次确诊的PSS患者为疾病组，其中男5例，女75例，年龄55～84〔平均(68.32±12.41)〕岁。另选取同期体检正常者80例为对照组，其中男4例，女76例，年龄55～85〔平均(69.15±13.25)〕岁。两组在年龄和性别构成上差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准，样品采集均取得患者及家属知情同意，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2纳入排除标准 纳入标准：①参照2012年美国《风湿病学协会干燥综合征诊断标准》〔5〕，首次诊断为PSS；②年龄≥50岁；③未进行激素、免疫抑制剂治疗；④自愿接受治疗研究，并能完成临床记录；排除标准：①有严重感染性疾病；②精神异常；③有严重脏器功能障碍或其他恶性肿瘤；④有糖尿病、高血压等疾病。

1.3主要试剂与仪器 Trizol试剂(编号：R0016)购自上海碧云天生物技术有限公司；PrimeScriptTMRT试剂盒(Perfect Real Time，编号RR037A)、PrimeScriptTMⅡ第一链cDNA合成试剂盒(编号：6210A)购自北京TaKaRa；引物由上海生工生物公司合成，miR-146a引物：上游5'-AGAACTGAATTCCATGGGTT-3',下游:5'-GACAGAGATATCCCAGCTGAAGAA-3';miR-155引物：上游5'-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3',下游:5'-CCTTAAAACTCCACTAGAAGCA-3';U6引物：上游5'-ATTGGA-ACGATACAGAGAAGATT-3'，下游:5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。MODEL550型酶标仪、实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)仪美国Bio-Rad公司、迈瑞5380生化仪、美国Beckman IMMAGE800生化仪等。

1.4样品采集及保存 采集PSS患者和对照组血液5 ml，于1 h内3 000 r/min室温离心5 min分离血清，冻存于-80℃冰箱备用。

1.5qRT-PCR检测血清中miR-146a、miR-155表达水平 采用Trizol试剂提取血清总RNA，反转录得到cDNA。采用定量PCR仪(Bio-Rad)对miR-146a和miR-155进行扩增。qRT-PCR反应采用20 μl体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/ μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反应采用两步法，条件设置为：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 34 s，40个循环；添加溶解曲线。采用2-ΔΔCT法对血清miR-146a和miR-155表达水平进行定量分析。

1.6血清指标检测 采用阻抗法检测血清白细胞(WBC)含量，采用免疫比浊法测定血清免疫球蛋白(Ig)G抗体水平，采用间接免疫荧光法检测血清抗核抗体(ANA)，采用免疫组化法检测血清抗SSA、抗SSB抗体。根据检测结果将疾病组分为抗ANA阳性(+)53例，抗ANA阴性(-)27例；抗SSA阳性(+)56例，抗SSA阴性(-)24例；抗SSB阳性(+)52例，抗SSB阴性(-)28例。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件进行χ2检验、t检验、Pearson相关系数分析、受试者工作特征(ROC)曲线分析。

2 结 果

2.1对照组与疾病组血清miR-146a、miR-155表达比较 与对照组比较，疾病组血清miR-146a表达水平显著升高(1.02±0.35 vs 3.28±0.71,t=25.536,P<0.001)，miR-155表达水平显著降低(1.13±0.27 vs 0.56±0.12,t=17.255,P<0.001)。

2.2对照组与疾病组WBC、血清IgG水平比较 与对照组比较，疾病组患者WBC数显著减少〔(7.95±2.61)×109/L vs(3.52±1.47)×109/L,t=13.228,P<0.001〕，血清中IgG水平显著增加〔(9.72±3.51)g/L vs (20.61±5.47)g/L,t=14.987,P<0.001〕。

2.3血清miR-146a、miR-155表达水平与PSS患者炎性损伤指标的关系 与抗ANA(-)组比较，抗ANA(+)组miR-146a表达水平显著升高，miR-155表达水平显著降低(P<0.001)；与抗SSA(-)组比较，抗SSA(+)组miR-146a表达水平显著升高，miR-155表达水平显著降低(P<0.001)；与抗SSB(-)组比较，抗SSB(+)组miR-146a表达水平显著升高，miR-155表达水平显著降低(P<0.001)。见表1。

表1 疾病组血清miR-146a、miR-155表达水平与炎症损伤指标间关系

2.4PSS患者血清miR-146a、miR-155表达水平的相关性 PSS患者血清中miR-146a与miR-155表达呈显著负相关(r=-0.718，P<0.05)。见图1。

图1 PSS患者血清miR-146a、miR-155表达水平的相关性

2.5PSS患者血清中miR-146a、miR-155与WBC、IgG水平的相关性 PSS患者血清中miR-146a与WBC呈显著负相关(r=-0.694，P<0.05)，与IgG呈显著正相关(r=0.690，P<0.05)；miR-155与WBC呈显著正相关(r=0.566，P<0.05)，与IgG呈显著负相关(r=-0.693，P<0.05)。见图2，图3。

2.6血清miR-146a、miR-155表达水平对PSS的诊断价值 分别以血清miR-146a、miR-155表达水平及二者联合预测值为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，血清miR-146a、miR-155表达水平诊断PSS的曲线下面积(AUC)为0.831、0.834，截断值为0.625、0.651，特异度为0.825、0.838，灵敏度为0.800、0.813；二者联合诊断PSS的AUC为0.884，截断值为0.688，特异度为0.925，灵敏度为0.763。见图4。

图2 PSS患者血清中miR-146a与WBC水平及IgG水平的相关性

图3 PSS患者血清中miR-155与WBC水平及IgG水平的相关性

图4 血清miR-146a、miR-155对PSS疾病的ROC曲线

3 讨 论

PSS属自身免疫性疾病范畴，临床典型表现为口、眼干燥，并可累及全身多种器官。该病好发于女性，尤其绝经后女性，严重威胁老年女性群体健康。目前临床唇腺活检及腮腺造影诊断PSS的特异性较高，但有创检测医疗费用高，在推广应用中受限〔6〕。因此寻找PSS敏感且特异的早期诊断指标对早发现、早治疗、有效控制病情发展意义重大。

近来研究表明，miRNA进化过程中高度保守，广泛存在于线虫、细菌、病毒、植物及哺乳动物中，参与生物体的生长、发育、细胞增殖、凋亡等多种生命活动〔7〕。研究发现，miRNAs表达和功能失调与多种疾病，如癌症〔8〕、肿瘤〔9〕及许多自身免疫性疾病类风湿性关节炎〔10〕、干燥综合征〔11〕等发生有关。miR-146a是一种与慢性炎性疾病有关的miRNA，在天然免疫和获得性免疫中有重要调控作用〔12〕。miR-155位于人类21号染色体上，是一个多功能miRNA，在淋巴细胞应答中发挥重要作用，还可介导炎症反应、呈递抗原、调控免疫过程中细胞因子生成等〔13〕。

Sun等〔14〕研究发现，miR-146a表达与PSS发生有关，可作为诊断PSS发生的生物标志。王笑颜等〔6〕研究发现，miR-146a-5p在PSS患者中表达上调。陈慕芝等〔15〕研究表明，miR-155在PSS患者外周血单个核细胞中显著低表达，与本研究结果一致。本研究结果发现，miR-146a在PSS患者血清中显著高表达，miR-155显著低表达，提示血清miR-146a、miR-155表达可能与PSS有关。研究发现，抗SSA抗体可能与PSS患者血液系统障碍尤其WBC减少密切相关〔6〕。van Woerkom等〔16〕研究发现PSS患者血清中IgG升高，且可作为判断PSS活动指标。本研究提示PSS发生伴随WBC减少，IgG抗体数增加。进一步分析提示miR-146a、miR-155可能与PSS发展及炎性损伤过程有关。研究表明，抗ANA、抗SSA、抗SSB是非特异性抗体，当自身免疫反应发生时，这些抗体水平会随免疫反应严重程度升高，其中抗SSA抗体常见于PSS和系统性红斑狼疮女性患者，抗SSB抗体几乎仅见于PSS患者，抗ANA、抗SSA、抗SSB抗体水平常作为临床诊断PSS实验室检测指标〔6〕，结合本研究结果提示miR-146a、miR-155水平变化可能与PSS患者炎症损伤程度有关。本研究提示而miR-16a、miR-155可能共同参与PSS疾病发生发展。进一步采用ROC曲线分析血清miR-146a、miR-155水平对PSS诊断价值提示联合检测血清miR-146a、miR-155水平对PSS疾病诊断的AUC显著增加，对PSS疾病诊断有一定参考价值，但本研究纳入样本量较少，其具体可行性有待深入探究。

综上，PSS患者血清中miR-146a高表达，miR-155低表达，二者呈负相关，可能作为诊断PSS疾病的潜在生物标志。